融合蛋白LTβR-Fc對(duì)卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的影響.pdf

1、特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis,AD）是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，常伴發(fā)哮喘、過(guò)敏性鼻炎和結(jié)膜炎等一系列癥狀，以劇烈瘙癢和睡眠障礙為主要特征。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為T細(xì)胞免疫異常在AD的發(fā)病環(huán)節(jié)中扮演了重要角色，AD的發(fā)病、皮損的持續(xù)存在與T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化以及產(chǎn)生的細(xì)胞因子功能異常有關(guān)。
　　共刺激分子在T淋巴細(xì)胞活化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。研究中針對(duì)其受體-配體結(jié)合的阻斷策略既可用于急性

2、移植免疫排斥反應(yīng)的預(yù)防，也可用于自身免疫抑制的維持。單純皰疹病毒侵入介質(zhì)配體(herpesvirus entry mediator ligand,HVEML,或稱LIGHT)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）配體超家族的一員，它參與許多炎癥性疾病的發(fā)病過(guò)程，其受體一般表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞，屬于單純皰疹病毒侵入介質(zhì)（herpesvirus entry mediator,HVEM)。
　　

3、研究證實(shí)，LIGHT共刺激分子參與了炎癥性腸疾病、強(qiáng)直性脊柱炎與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)病進(jìn)程，而特應(yīng)性皮炎患者外周血血清中LIGHT的表達(dá)水平較健康者顯著上調(diào)，且與患者血清內(nèi)IgE的水平以及濕疹面積與嚴(yán)重度指數(shù)（eczema area and severity index，EASI）顯著相關(guān)。因此，本研究擬探討單純皰疹病毒侵入介質(zhì)配體信號(hào)通路LIGHT-HVEM阻斷抗體LTβR-Fc融合蛋白對(duì)卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的影響，以進(jìn)一步

4、探索LIGHT-HVEM信號(hào)通路在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　第一部分、IL-4、IL-5和IFN-γ在皮炎小鼠模型中的表達(dá)
　　目的:檢測(cè)LIGHT-HVEM阻斷抗體LTβR-Fc融合蛋白建立的皮炎小鼠模型皮損處及脾細(xì)胞上清液內(nèi)白介素（IL）-4、IL-5和干擾素γ（IFN-γ）的表達(dá)，并分析LIGHT-HVEM信號(hào)通路在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:將BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（以100μl生理氯化鈉溶

5、液進(jìn)行刺激）、模型組（將100μg卵清蛋白溶于100μl生理氯化鈉溶液中進(jìn)行刺激）以及阻斷劑組（在卵清蛋白致敏前24h將100μg LTβR-Fc溶于100μl生理氯化鈉溶液作為阻斷藥物進(jìn)行刺激），于造模結(jié)束時(shí)處死各組小鼠，用RT-PCR法檢測(cè)小鼠皮損處IL-4、IL-5和IFN-γ的mRNA表達(dá)情況，用ELISA法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞上清液內(nèi)IL-4、IL-5和IFN-γ的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:融合蛋白LTβR-Fc顯著抑制了卵清

6、蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的炎癥反應(yīng)。皮炎小鼠模型組與阻斷劑組小鼠皮損處IL-4 mRNA（1.81±0.25 vs0.88±0.25）、IL-5 mRNA（1.24±0.26 vs0.75±0.15）、IFN-γmRNA（1.11±0.19 vs0.62±0.09）水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），脾細(xì)胞上清液內(nèi)IL-4蛋白[(20.12±5.39)ng/L vs(9.58±1.44)ng/L]、IL-5蛋白[(22.77±4.07

7、)ng/L vs(11.37±2.02)ng/L]、IFN-γ蛋白[（23930±44.20）ng/L vs(16167±950.40)ng/L]水平差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:融合蛋白阻斷抗體LTβR-Fc通過(guò)阻斷LIGHT-HVEM信號(hào)通路可以顯著下調(diào)卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的IL-4、IL-5和IFN-γ，提示LIGHT-HVEM可以作為特應(yīng)性皮炎的潛在治療靶點(diǎn)。
　　第二部分、皮炎小鼠模型血清

8、中總IgE、IgG1以及卵清蛋白特異性IgE、IgG1的表達(dá)水平
　　目的:評(píng)估LIGHT-HVEM阻斷抗體LTβR-Fc融合蛋白建立的皮炎小鼠模型的濕疹面積與嚴(yán)重度指數(shù)（eczema area and severity index,EASI），并檢測(cè)皮炎小鼠模型血清中總的以及卵清蛋白特異性的IgE、IgG1的表達(dá)，分析LIGHT-HVEM信號(hào)通路在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:將BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（以1

9、00μl生理氯化鈉溶液進(jìn)行刺激）、模型組（將100μg卵清蛋白溶于100μl生理氯化鈉溶液中進(jìn)行刺激）以及阻斷劑組（在卵清蛋白致敏前24h將100μg LTβR-Fc溶于100μl生理氯化鈉溶液作為阻斷藥物進(jìn)行刺激），在開(kāi)始致敏后第0、4、8、12、15、20、23、27、31、34天分別對(duì)各組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行病情嚴(yán)重程度評(píng)分，同時(shí)測(cè)量皮損面積大小，最后于造模結(jié)束行眼眶取血，提取血清后處死各組小鼠，用ELISA方法檢測(cè)血清內(nèi)總的IgE、Ig

10、G1以及卵清蛋白特異性的IgE、IgG1的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:融合蛋白LTβR-Fc顯著抑制了卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的炎癥反應(yīng)。與模型組相比，阻斷劑組小鼠皮損面積顯著減少（P<0.05），EASI明顯降低（P<0.05）。皮炎小鼠模型組與阻斷劑組血清內(nèi)總的 IgE[(32277.00±407.53)μg/L vs27446367±2052.64)μg/L]和IgG1[(2323.33±502.43)μg/L vs(1296.

11、33±32.72)μg/L]水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，血清內(nèi)卵清蛋白特異性的IgE[(0.84±0.11)μg/L vs(0.46±0.10)μg/L]和IgG1[(0.86±0.07)μg/L vs(0.62±0.10)μg/L]亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:融合蛋白LTβR-Fc可以通過(guò)阻斷共刺激分子LIGHT，促使皮炎模型EASI降低，同時(shí)血清總的與卵清蛋白特異性的IgE、IgG1顯著下調(diào)，提示LIGHT-HVEM信號(hào)通路可作