雌激素受體α依賴CYP1B1和ERK促進(jìn)NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生.pdf

1、目的(1)明確ERα在人肺癌組織和A/J小鼠肺癌組織中的表現(xiàn);(2)證明ERα和CYP1B1參與NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生;(3)探討ERα促進(jìn)NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的分子機(jī)制。
　　方法首先:收集30例肺癌患者術(shù)后腫瘤和非腫瘤組織標(biāo)本，用福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，通過免疫組織化學(xué)染色觀察人肺組織中ERα的表達(dá)情況，對(duì)比肺癌患者正常肺組織和腫瘤組織中ERα蛋白表達(dá)情況。其次:利用單劑量NNK(100mg/kg)腹腔注射給藥的方式建立A/

2、J小鼠肺癌模型，采用HE染色觀察該過程中小鼠肺腫瘤的生長情況，利用免疫組織化學(xué)染色對(duì)比NNK誘導(dǎo)組小鼠和對(duì)照組小鼠肺組織中ERα的表達(dá)，通過Western blot、real time-PCR分析，對(duì)比肺組織中ERα的蛋白及mRNA水平。簡要步驟如下:將160只6周齡清潔級(jí)A/J小鼠隨機(jī)分為2組，每組80只，每籠10只，分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組通過腹腔注射給予單劑量NNK（生理鹽水溶解）;對(duì)照組僅給予同等體積生理鹽水。于NNK處理后第26周開始

3、處死小鼠，每4周1次，每次10只，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。取小鼠肺組織，將左肺浸泡于福爾馬林溶液中固定、石蠟包埋、切片，制成5μm厚切片用于免疫組織化學(xué)染色和HE染色;右肺保存于-80℃待提取核蛋白、總蛋白和總RNA，用于進(jìn)行Western blot、real time-PCR和基因芯片等分析。第三:利用Western blot檢測NNK處理組小鼠肺組織中CYP1B1的表達(dá)變化，觀察其與ERα表達(dá)改變的相似度。通過基因芯片技術(shù)尋找在NNK誘導(dǎo)小鼠

4、肺癌發(fā)生過程中與ERα、CYP1B1有關(guān)的信息，包括信號(hào)通路、基因網(wǎng)絡(luò)等。利用這些信息判定ERα和CYP1B1是否參與NNK誘導(dǎo)A/J小鼠肺癌的發(fā)生。最后:利用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H23和NCI-H460探討ERα、CYP1B1在NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生中的作用及分子機(jī)制。(a)細(xì)胞培養(yǎng):2株細(xì)胞均采用DMEM+10％FBS培養(yǎng)基，于37℃、5％ CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體內(nèi)容采取不同分組及處理，主要干預(yù)因子包括N

5、NK、U0126和siRNA。(b)通過Western blot分析和免疫熒光染色檢驗(yàn)NNK處理后的細(xì)胞中CYP1B1、ERα蛋白表達(dá)變化，觀察其表現(xiàn)是否與NNK誘導(dǎo)的小鼠組織一致。(c)利用流式細(xì)胞術(shù)觀察ERα siRNA和CYP1B1 siRNA干預(yù)后細(xì)胞的凋亡情況，判定ERα、CYP1B1在NNK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖中的作用。(d)通過Western blot分析，觀察NNK誘導(dǎo)及siRNA干擾雙重作用下細(xì)胞中CYP1B1、ERα的蛋

6、白表達(dá)變化，判斷二者的調(diào)控關(guān)系。(e)采用Western blot分析檢測RAS/ERK/AP1信號(hào)通路相關(guān)蛋白在NNK誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，觀察該信號(hào)通路是否參與NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生。檢測的蛋白包括:ERK、p-ERK、c-Fos、c-Jun、pdcd4、spry1、spry2和btg2。(f)利用Western blot分析檢測ERK特異性抑制劑(U0126)處理后細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，驗(yàn)證RAS/ERK/AP1信號(hào)通路參與NNK誘

7、導(dǎo)肺癌發(fā)生。檢測的蛋白同(e)。同時(shí)，觀察ERα、CYP1B1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)改變，進(jìn)一步確認(rèn)ERα、CYP1B1在NNK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖中的作用。(g）通過Western blot分析，觀察CYP1B1 siRNA、ERαsiRNA處理后RAS/ERK/AP1信號(hào)通路相關(guān)蛋白及抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，分析ERα促進(jìn)NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生是否需要CYP1B1和ERK的活化。(h)畫出可能的調(diào)控圖。
　　結(jié)果(1)從免疫組織化

8、學(xué)染色結(jié)果看，人肺癌組織中ERα蛋白表達(dá)較癌旁正常組織顯著升高，且主要集中于細(xì)胞核;腫瘤組織中ERα表達(dá)平均分為3.5分，ERα表達(dá)陽性的細(xì)胞占41％-60％。(2) HE染色結(jié)果顯示，隨著NNK作用時(shí)間延長小鼠肺組織中腫瘤細(xì)胞比例增加，最后形成大面積的瘤體;免疫組織化學(xué)染色顯示，NNK處理組的ERα表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且主要集中于細(xì)胞核中，這與在人肺癌組織中觀察到的現(xiàn)象一致，并且第26周至第54周腫瘤組織中ERα表達(dá)平均分為4.5分，

9、陽性細(xì)胞比例占80％以上。Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，隨著NNK誘導(dǎo)時(shí)間的延長小鼠腫瘤組織中ERα蛋白水平逐漸升高，并一直高于對(duì)照組。ERα mRNA水平表達(dá)同樣隨NNK作用時(shí)間的延長呈上升趨勢，其中第30周、第34周差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(3) Western blot檢測結(jié)果顯示，在NNK誘導(dǎo)的A/J小鼠肺癌發(fā)展過程中，CYP1B1表達(dá)明顯增加，并且CYP1B1表達(dá)增加的時(shí)間和趨勢部分與E

10、Rα變化重疊。基因水平檢測顯示，NNK誘導(dǎo)第34周時(shí)的小鼠肺組織中ERα、CYP1B1編碼基因的水平分別較對(duì)照組增加8倍、6倍?；蛐酒盘?hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，ERα、Cyp1b1共同參與了NNK誘導(dǎo)的小鼠肺癌發(fā)生，二者參與的信號(hào)通路共8條，其中包括ERK/MAPK信號(hào)通路。基因芯片網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，在NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生發(fā)展過程中有3個(gè)功能不同的高分值(＞15)基因網(wǎng)含有ERα和Cyp1b1，其中ERα和Cyp1b1同時(shí)參與藥物代謝和小分子

11、生物化學(xué)反應(yīng)。這與二者的生物學(xué)功能有關(guān)，也可能與NNK代謝有關(guān)。(4)(a)體外研究結(jié)果顯示，NNK處理后的NCI-H23、NCI-H460細(xì)胞中ERα、CYP1B1表達(dá)上調(diào)，其中ERα主要在細(xì)胞核中表達(dá)，細(xì)胞核蛋白中ERα表達(dá)增幅較對(duì)照組高。該結(jié)果與在NNK處理的A/J小鼠肺組織及人肺腫瘤組織中所獲得的數(shù)據(jù)相符。(b)先轉(zhuǎn)染CYP1B1 siRNA和ERα siRNA后加NNK處理的NCI-H23、NCI-H460細(xì)胞凋亡率明顯上升，

12、轉(zhuǎn)染了CYP1B1 siRNA的NCI-H460細(xì)胞凋亡率甚至高達(dá)80％。同時(shí)，經(jīng)過轉(zhuǎn)染CYP1B1 siRNA的細(xì)胞與沒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比NNK導(dǎo)致的ERα上調(diào)受到明顯抑制，而轉(zhuǎn)染ERα siRNA的細(xì)胞中CYP1B1幾乎無變化。說明，抑制CYP1B1表達(dá)可以減少ERα，但阻斷Eα的表達(dá)并不能削弱NNK對(duì)CYP1B1的影響。(c)分析ERK/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，NNK處理后NCI-H23、NCI-H460中p-ERK、

13、c-Fos和c-Jun表達(dá)均明顯升高，并且c-Fos、c-Jun表達(dá)升高與p-ERK基本平行。與c-Fos、c-Jun不同，Ras/ERK/AP1多重負(fù)性調(diào)節(jié)因子pdcd4、spry1、spry2和btg2在NNK作用后總體呈時(shí)間依賴的下降趨勢。然而，ERK特異性抑制劑(U0126)預(yù)處理后再經(jīng)NNK作用的NCI-H23、NCI-H460相比單純NNK處理的細(xì)胞而言，c-Fos和c-Jun表達(dá)降低，Pdcd4、Spry1、Spry2、B

14、tg2表達(dá)升高。(d) Western blot分析發(fā)現(xiàn):與單純NNK處理組相比，U0126作用后NNK導(dǎo)致的ERα上調(diào)受到抑制，ERα表達(dá)降低;與ERα相反，U0126阻斷ERK后CYP1B1表達(dá)與單純NNK作用組相比有所升高。此結(jié)果與siRNA干擾后的結(jié)果相似。此外，U0126作用下，抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡能力增加。綜上所述，ERα可保護(hù)腫瘤細(xì)胞防止細(xì)胞凋亡，該作用需要通過依賴CYP1B