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文檔簡介
1、目的:通過檢測食管鱗癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)患者腫瘤組織及癌旁組織中橋接整合因子-1(bridging integrator-1, Bin1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metal proteinase-9, MMP-9)的表達情況,分析ESCC中Bin1、VEGF、MMP
2、-9的表達與患者臨床病理特征的關系,探討B(tài)in1在腫瘤血管形成和侵襲轉移中的作用。構建攜帶Bin1基因的病毒載體,篩選Bin1低表達的ESCC細胞,以慢病毒為載體進行基因轉染,應用體外實驗研究Bin1對ESCC細胞株KYSE30侵襲和遷移能力的影響,并探討其作用機制。
方法:
1、收集2014年1月至2015年1月期間河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科手術切除的72例ESCC患者的腫瘤組織和癌旁組織,將每例標本分為2份,1份
3、標本迅速置于液氮中,后于-80℃超低溫冰箱中貯存以備提取RNA;另1份以4%甲醛溶液固定以備制作蠟塊,用于免疫組化染色。
2、應用免疫組化和RT-PCR方法檢測腫瘤組織和癌旁組織中Bin1和VEGF、MMP-9的蛋白表達和基因表達水平,分析其表達情況之間的關系,分析食管鱗癌組織中Bin1和VEGF、MMP-9表達與患者臨床病理特征的關系。
3、采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantificational real
4、-time polymerase chainreaction, qRT-PCR)方法檢測Bin1在TE13、TE1、KYSE30、Eca109和Yes-2五種人食管鱗癌細胞株中的表達情況,篩選出Bin1低表達的食管鱗癌細胞 KYSE30。構建攜帶Bin1基因的慢病毒載體,以病毒轉染的方式將Bin1基因轉入KYSE30細胞(Bin1+組),并分別設置空載體組(Bin1-組)和空白對照組(Control組),經(jīng)RT-PCR和Western
5、blot方法鑒定,獲得穩(wěn)定轉染Bin1的細胞。
4、利用細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測各組細胞的遷移能力和侵襲能力的變化;Western blot實驗檢測 Bin1對細胞遷移相關蛋白MMP-9和E鈣粘蛋白(E-cadherin, E-cad)的表達水平,探討B(tài)in1影響食管鱗癌細胞侵襲轉移機制。
結果:1.與癌旁組織相比,ESCC組織中Bin1 mRNA表達水平和蛋白陽性表達率顯著降低(0.17±0.1
6、2 vs.0.33±0.18,38.89% vs.80.56%, P<0.05);VEGF、MMP-9 mRNA表達水平和蛋白陽性表達率顯著升高(0.41±0.19 vs.0.28±0.18,68.05%vs.45.83%, P<0.05)和(0.40±0.14 vs.0.25±0.15,55.56%vs.33.33%,P<0.05)。在基因和蛋白表達水平上ESCC腫瘤組織和癌旁組織中 Bin1與 VEGF、MMP-9呈顯著負相關關系(
7、P<0.05);2 Bin1和VEGF、MMP-9的表達水平與ESCC患者的腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移相關,與患者性別、年齡無關;3.檢測TE13、TE1、KYSE30、Eca109和Yes-2五種人食管鱗癌細胞株Bin1 mRNA的表達水平,篩選出Bin1表達水平最低的KYSE30細胞,用于后續(xù)實驗。與Bin1-組和Control組相比,Bin1+組KYSE30細胞中Bin1基因和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05
8、),說明Bin1已成功轉入KYSE30細胞中。以G418篩選的方式獲得穩(wěn)轉的Bin1+細胞和Bin1-細胞;4細胞劃痕實驗結果顯示,劃痕12h和24h后,Bin1+組細胞遷移距離為(25.4±2.5 vs.58.6±3.7)um,Bin1-組細胞遷移距離為(58.1±5.3 vs.92.4±4.4)um, Control組細胞遷移距離為(60.2±4.1 vs.89.6±5.7)um。Bin1+組遷移距離在12h及24h后與Bin1-組
9、和Control組相比均明顯縮短,有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Bin1-組和Control組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明Bin1能夠影響KYSE30細胞的遷移能力。Transwell實驗顯示,Bin1+組、Bin1-組、Control組穿膜細胞數(shù)分別為51.50±3.15、125.00±4.25、131.00±4.37, Bin1+組穿膜細胞數(shù)較 Bin1-組和 Control組均顯著降低(P<0.05),Bin1-組和Co
10、ntrol組穿膜細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05),說明Bin1基因轉染后能夠抑制KYSE30細胞的侵襲能力。Western blot檢測細胞中與遷移侵襲相關的蛋白MMP-9和E-cad,結果顯示,與Bin1-組和Control組相比, Bin1+組MMP-9表達較Bin1-組和Control組均顯著降低(P<0.05),E-cad表達顯著升高(P<0.05),說明Bin1通過影響MMP-9和E-cad的表達降低KYSE30細胞遷移侵襲
11、能力。
結論:
1、ESCC腫瘤組織中Bin1表達水平降低,VEGF、MMP-9表達水平增高,Bin1和VEGF、MMP-9的表達呈顯著負相關關系,與患者腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移密切相關。說明ESCC腫瘤組織中Bin1低表達與ESCC侵襲轉移等惡性行為相關。
2、體外實驗通過慢病毒轉染建立穩(wěn)定表達 Bin1的 ESCC細胞KYSE30,Bin1轉染后KYSE30細胞的遷移和侵襲能力顯著
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