Bin1抑制食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的：通過(guò)檢測(cè)食管鱗癌（esophageal squamous cell cancer, ESCC）患者腫瘤組織及癌旁組織中橋接整合因子-1（bridging integrator-1, Bin1）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metal proteinase-9, MMP-9）的表達(dá)情況，分析ESCC中Bin1、VEGF、MMP

2、-9的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，探討B(tài)in1在腫瘤血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。構(gòu)建攜帶Bin1基因的病毒載體，篩選Bin1低表達(dá)的ESCC細(xì)胞，以慢病毒為載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)研究Bin1對(duì)ESCC細(xì)胞株KYSE30侵襲和遷移能力的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、收集2014年1月至2015年1月期間河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的72例ESCC患者的腫瘤組織和癌旁組織，將每例標(biāo)本分為2份，1份

3、標(biāo)本迅速置于液氮中，后于-80℃超低溫冰箱中貯存以備提取RNA；另1份以4％甲醛溶液固定以備制作蠟塊，用于免疫組化染色。
　　2、應(yīng)用免疫組化和RT-PCR方法檢測(cè)腫瘤組織和癌旁組織中Bin1和VEGF、MMP-9的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)水平，分析其表達(dá)情況之間的關(guān)系，分析食管鱗癌組織中Bin1和VEGF、MMP-9表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。
　　3、采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantificational real

4、-time polymerase chainreaction, qRT-PCR）方法檢測(cè)Bin1在TE13、TE1、KYSE30、Eca109和Yes-2五種人食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，篩選出Bin1低表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞 KYSE30。構(gòu)建攜帶Bin1基因的慢病毒載體，以病毒轉(zhuǎn)染的方式將Bin1基因轉(zhuǎn)入KYSE30細(xì)胞（Bin1+組），并分別設(shè)置空載體組（Bin1-組）和空白對(duì)照組（Control組），經(jīng)RT-PCR和Western

5、blot方法鑒定，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bin1的細(xì)胞。
　　4、利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力的變化；Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Bin1對(duì)細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP-9和E鈣粘蛋白（E-cadherin, E-cad）的表達(dá)水平，探討B(tài)in1影響食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　結(jié)果：1.與癌旁組織相比，ESCC組織中Bin1 mRNA表達(dá)水平和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低（0.17±0.1

6、2 vs.0.33±0.18，38.89% vs.80.56%, P<0.05）；VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)水平和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高（0.41±0.19 vs.0.28±0.18，68.05%vs.45.83%, P<0.05）和（0.40±0.14 vs.0.25±0.15，55.56%vs.33.33%，P<0.05）。在基因和蛋白表達(dá)水平上ESCC腫瘤組織和癌旁組織中 Bin1與 VEGF、MMP-9呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（

7、P<0.05）；2 Bin1和VEGF、MMP-9的表達(dá)水平與ESCC患者的腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者性別、年齡無(wú)關(guān)；3.檢測(cè)TE13、TE1、KYSE30、Eca109和Yes-2五種人食管鱗癌細(xì)胞株Bin1 mRNA的表達(dá)水平，篩選出Bin1表達(dá)水平最低的KYSE30細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與Bin1-組和Control組相比，Bin1+組KYSE30細(xì)胞中Bin1基因和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05

8、），說(shuō)明Bin1已成功轉(zhuǎn)入KYSE30細(xì)胞中。以G418篩選的方式獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)的Bin1+細(xì)胞和Bin1-細(xì)胞；4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕12h和24h后，Bin1+組細(xì)胞遷移距離為（25.4±2.5 vs.58.6±3.7）um，Bin1-組細(xì)胞遷移距離為（58.1±5.3 vs.92.4±4.4）um， Control組細(xì)胞遷移距離為（60.2±4.1 vs.89.6±5.7）um。Bin1+組遷移距離在12h及24h后與Bin1-組

9、和Control組相比均明顯縮短，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Bin1-組和Control組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明Bin1能夠影響KYSE30細(xì)胞的遷移能力。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，Bin1+組、Bin1-組、Control組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為51.50±3.15、125.00±4.25、131.00±4.37， Bin1+組穿膜細(xì)胞數(shù)較 Bin1-組和 Control組均顯著降低（P<0.05），Bin1-組和Co

10、ntrol組穿膜細(xì)胞數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），說(shuō)明Bin1基因轉(zhuǎn)染后能夠抑制KYSE30細(xì)胞的侵襲能力。Western blot檢測(cè)細(xì)胞中與遷移侵襲相關(guān)的蛋白MMP-9和E-cad，結(jié)果顯示，與Bin1-組和Control組相比， Bin1+組MMP-9表達(dá)較Bin1-組和Control組均顯著降低（P<0.05），E-cad表達(dá)顯著升高（P<0.05），說(shuō)明Bin1通過(guò)影響MMP-9和E-cad的表達(dá)降低KYSE30細(xì)胞遷移侵襲

11、能力。
　　結(jié)論：
　　1、ESCC腫瘤組織中Bin1表達(dá)水平降低，VEGF、MMP-9表達(dá)水平增高，Bin1和VEGF、MMP-9的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與患者腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。說(shuō)明ESCC腫瘤組織中Bin1低表達(dá)與ESCC侵襲轉(zhuǎn)移等惡性行為相關(guān)。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達(dá) Bin1的 ESCC細(xì)胞KYSE30，Bin1轉(zhuǎn)染后KYSE30細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著