腎母細胞瘤中轉化生長因子β信號通路差異表達基因的篩選、臨床意義及缺氧誘導因子1α介導侵襲性的機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究的目的是通過收集Wilms Tumor病人的臨床病理資料、病理組織標本和隨訪情況，采用分子生物學的方法檢測病人腎母細胞瘤標本TGF-β信號通路超家族中84個重要基因中的突變差異情況，并且進行篩選和驗證，最后與臨床病理學指標進行相關性的分析，以期建立更加精確診斷、預測腎母細胞瘤病人預后情況的方法。另外利用SK-NEP-1人腎母細胞瘤細胞株在低氧環(huán)境中培養(yǎng)，模擬建立體外低氧環(huán)境下腫瘤細胞培養(yǎng)的模型，對比正常氧濃度環(huán)境

2、下的結果，分析SK-NEP-1人腎母細胞瘤細胞的形態(tài)變化、生長情況。檢測HIF-1α表達量，用以說明SK-NEP-1人腎母細胞瘤細胞在兩種環(huán)境中表達水平的變化。另外檢測SK-NEP-1人腎母細胞瘤細胞中上皮細胞的標志性蛋白，即上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)，間質細胞的標志性蛋白，即波形蛋白(Vimentin)的表達量，從而分析HIF-1α在Wilms Tumor中是否通過EMT轉化的作用機制增加腫瘤侵襲性和遷移能力。最后推測我們進

3、一步治療可能的靶點和逆轉途徑。
　　方法：
　　1、臨床WT組織標本的收集、分組
　　本研究通過廣州市婦女兒童醫(yī)療中心倫理委員會批準，可以進行本實驗。收集本中心治療的，2010年1月至2012年12月符合單側Wilms Tumor病理診斷的臨床病例28例。所有術前化療及雙側Wilms Tumor的病例均排除在本實驗之外。手術中分別取了28例病人瘤體標本作為腫瘤組（28例）和癌旁腎組織作為癌旁組（28例）。
　　2

4、、臨床腫瘤標本組織處理及RNA的提取和檢測
　　Wilms Tumor腫瘤組織作為腫瘤組，癌旁腎組織作為癌旁組，分別提取總的RNA。用核酸蛋白定量儀(NanoDrop2000/2000 ultra-micro uv-vis分光光度計)檢測OD260/OD280，判斷提取RNA的濃度;為了排除RNA有降解或基因組DNA有污染，取溶解好的RNA溶液置于1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，以RIN(RNAIntegrity Number)的值、

5、28S和18S的比例及條帶清晰程度，用以觀察樣品總RNA的純度和完整性。
　　3、TGF-β/BMP信號通路突變的差異基因的初步篩查
　　隨機抽取前述Wilms Tumor腫瘤的Ⅰ期、Ⅱ期組織標本各1例，Ⅲ期組織標本2例，予以混合RNA，用于初步篩查，利用Human TGF-β/BMP Signaling PathwayPCR Array標準試劑盒檢測信號通路84個基因的突變差異情況。
　　結果：
　　1、TGF

6、-β信號傳導通路超家族差異基因的篩選和驗證
　　對臨床Wilms Tumor組織標本提取的總RNA數(shù)量、質量及完整性進行檢測，結果符合進一步實驗的標準。
　　Human TGF-β/BMP Signaling Pathway PCR Array標準試劑盒檢測TGF-β信號傳導通路超家族中84個基因的突變差異情況，初步篩選出7個腫瘤組與癌旁組比較，mRNA表達量大于10倍的可能的突變差異基因，分別是AMH（抗苗勒氏管激素）（1

7、2.07倍）、BMPR1A（骨形態(tài)生成蛋白1A型受體）(27.15倍)、CHRD（腱蛋白）（43.40倍）、COL1A2（Ⅰ型膠原）（10.45倍）、GDF2（生長分化因子2）（27.84倍）、IGF（胰島素樣生長因子1）（14.54倍）、NROB1（核受體家族）（11.18倍）。
　　RT-PCR方法在28例Wilms Tumor病人的腫瘤組織和癌旁腎組織中驗證的結果是BMPR1A(p=0.036＜0.05)和NROB1(p=0

8、.039＜0.05)是突變的差異基因。
　　2、BMPR1A基因表達與Wilms Tumor病人臨床病理資料的相關性分析
　　BMPR1A基因的表達在臨床病理資料各因素內（性別、年齡、分期、侵襲和轉移、復發(fā)、病理類型）比較，P均大于0.05，各組內沒有明顯差異。
　　3、SK-NEP-1人腎母細胞瘤在不同氧濃度下細胞培養(yǎng)的形態(tài)學評估
　　在正常組中，腫瘤細胞顯示多邊形，排列規(guī)則緊密。在低氧誘導組中，腫瘤細胞顯示橢

9、圓形或紡錘形，排列松散且不規(guī)則。
　　4、缺氧誘導組及正常組人Wilms Tumor SK-NEP-1細胞HIF-1α mRNA水平的比較
　　對SK-NEP-1人腎母細胞瘤細胞株培養(yǎng)的正常組及缺氧誘導組中分別提取RNA數(shù)量、質量及完整性進行檢測，結果顯示符合進一步實驗的標準。
　　RT-PCR檢測結果顯示缺氧誘導組（6.36±0.76）中HIF-1α mRNA表達水平明顯上升，并且顯著高于正常組(2.69±0.86)

10、(p＜0.05)。
　　5、缺氧誘導組及正常組上皮細胞-間充質細胞轉化相關蛋白水平表達的比較
　　利用Western blotting方法分別檢測HIF-1α、Vimentin、E-cadherin及Actin蛋白的表達，結果顯示HIF-1α和Vimentin的蛋白水平在缺氧誘導組中明顯上升并高于正常組（0.96±0.15 vs0.51±0.06;1.01±0.13 vs0.81±0.06，p＜0.05），而E-cadher

11、in的蛋白水平在缺氧誘導組中下降并明顯低于正常組(1.03±0.13 vs1.15±0.11，p＜0.05)。
　　6、缺氧誘導組和正常組SK-NEP-1人Wilms Tumor細胞侵襲性和遷移性能力
　　利用Transwell遷移實驗和侵襲性實驗方法檢測結果:兩組WT細胞數(shù)目檢測結果發(fā)現(xiàn)兩種膠膜中腫瘤細胞數(shù)在缺氧誘導組中顯著高于正常組。(P＜0.05)
　　討論：
　　1、利用PCR芯片的方法在臨床腎母細胞瘤腫

12、瘤組織標本中篩選出TGF-β信號傳導通路超家族中突變差異基因為BMPR1A和NROB1
　　TGF-β/BMP信號傳導通路PCR芯片檢測并在大樣本中驗證出突變差異基因為BMPR1A和NROB1。
　　BMPR1A(骨形態(tài)生成蛋白1A型受體)基因位于人染色體10q23，又稱ALK3。它在TGF-β信號傳導通路超家族中屬于TGF-β細胞因子超家族受體的類別。文獻證實在乳腺腫瘤中，BMPR1A的缺乏不僅影響腫瘤細胞增殖的啟動，而且

13、會影響腫瘤細胞的上皮間質轉化作用，其高表達會明顯增加乳腺癌的侵襲性。利用小鼠敲除BMPR1A模型能夠證實干預BMP的受體能夠給治療高分期的神經(jīng)膠質瘤更好的幫助。miR-656能夠抑制神經(jīng)膠質瘤的生長和進展，是通過抑制BMPR1A的表達。
　　而在本研究中，BMPR1A基因mRNA在WT腫瘤組織中明顯升高，可以說明其在Wilms Tumor的發(fā)生和進展中起到了重要作用，進而影響了TGF-β信號傳導通路超家族在腫瘤中的作用，可能促進了

14、腫瘤的生長、侵襲和轉移。但是具體的的影響機制不明確，是否對其進行干預能夠延緩腫瘤的生長等還有待進一步的體外和體內實驗證實。
　　NROB1目前與腫瘤的相關研究較少，擬進一步明確表達的臨床相關性后再對NROB1的表達升高與Wilms Tumor關系進行討論。
　　2、TGF-β/BMP信號傳導通路超家族突變差異基因BMPR1A表達的增加與臨床病理特點的相關分析暫時無明顯意義，需要進一步增加病例數(shù)后明確相關關系
　　我們對

15、病人的術前信息、術后腫瘤的分期、侵襲和轉移（淋巴結、輸尿管、腎盂、腎內和腎外血管）、復發(fā)和病理類型（預后良好型和預后差型），分別和BMPR1A mRNA的檢測量進行統(tǒng)計學相關分析的比較。結果顯示BMPR1AmRNA升高在這些臨床因素中沒有明顯統(tǒng)計學差異。
　　這可能與本次研究的病例數(shù)不足有關，應該聯(lián)合多家中心，擴大病例數(shù)。增加比較的因素，如存活率和無瘤存活率等，可能可以找到有價值的臨床意義。
　　3、缺氧誘導條件下腎母細胞瘤

16、腫瘤SK-NEP-1細胞生長的模型是研究HIF-1α的一個很好的體外模型
　　4、HIF-1α在人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞缺氧誘導模型中是通過介導上皮間質轉化的作用機制，在腫瘤的侵襲和轉移中起到重要作用
　　缺氧微環(huán)境能夠上調人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞表達HIF-1α，促進了該腫瘤細胞的形態(tài)轉變，提高了其組織侵襲性和遷移性的能力。Vimentin蛋白表達的上調和E-cadherin蛋白的下調也提示腫瘤細胞的EMT

17、能夠促進其轉移。如果能夠通過阻斷HIF-1α下游信號通路的傳導來改善腫瘤微環(huán)境，這樣可能是一個有效抑制腫瘤侵襲和遠處轉移的方案。盡管這需要明確更多的機制和進一步的研究，但是這能夠給我們控制腫瘤的快速生長和轉移提供了思路，給一些臨床病人的手術治療帶來更多的希望。
　　結論：
　　1、腎母細胞瘤中TGF-β信號傳導通路超家族中突變差異基因為BMPR1A和NROB1。BMPR1A表達的增加暫時未發(fā)現(xiàn)與臨床病理學因素有相關性，需要進