腎母細(xì)胞瘤中轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路差異表達(dá)基因的篩選、臨床意義及缺氧誘導(dǎo)因子1α介導(dǎo)侵襲性的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究的目的是通過收集Wilms Tumor病人的臨床病理資料、病理組織標(biāo)本和隨訪情況，采用分子生物學(xué)的方法檢測病人腎母細(xì)胞瘤標(biāo)本TGF-β信號通路超家族中84個(gè)重要基因中的突變差異情況，并且進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，最后與臨床病理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性的分析，以期建立更加精確診斷、預(yù)測腎母細(xì)胞瘤病人預(yù)后情況的方法。另外利用SK-NEP-1人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株在低氧環(huán)境中培養(yǎng)，模擬建立體外低氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的模型，對比正常氧濃度環(huán)境

2、下的結(jié)果，分析SK-NEP-1人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的形態(tài)變化、生長情況。檢測HIF-1α表達(dá)量，用以說明SK-NEP-1人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞在兩種環(huán)境中表達(dá)水平的變化。另外檢測SK-NEP-1人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，即上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)，間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，即波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)量，從而分析HIF-1α在Wilms Tumor中是否通過EMT轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制增加腫瘤侵襲性和遷移能力。最后推測我們進(jìn)

3、一步治療可能的靶點(diǎn)和逆轉(zhuǎn)途徑。
　　方法：
　　1、臨床WT組織標(biāo)本的收集、分組
　　本研究通過廣州市婦女兒童醫(yī)療中心倫理委員會批準(zhǔn)，可以進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。收集本中心治療的，2010年1月至2012年12月符合單側(cè)Wilms Tumor病理診斷的臨床病例28例。所有術(shù)前化療及雙側(cè)Wilms Tumor的病例均排除在本實(shí)驗(yàn)之外。手術(shù)中分別取了28例病人瘤體標(biāo)本作為腫瘤組（28例）和癌旁腎組織作為癌旁組（28例）。
　　2

4、、臨床腫瘤標(biāo)本組織處理及RNA的提取和檢測
　　Wilms Tumor腫瘤組織作為腫瘤組，癌旁腎組織作為癌旁組，分別提取總的RNA。用核酸蛋白定量儀(NanoDrop2000/2000 ultra-micro uv-vis分光光度計(jì))檢測OD260/OD280，判斷提取RNA的濃度;為了排除RNA有降解或基因組DNA有污染，取溶解好的RNA溶液置于1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，以RIN(RNAIntegrity Number)的值、

5、28S和18S的比例及條帶清晰程度，用以觀察樣品總RNA的純度和完整性。
　　3、TGF-β/BMP信號通路突變的差異基因的初步篩查
　　隨機(jī)抽取前述Wilms Tumor腫瘤的Ⅰ期、Ⅱ期組織標(biāo)本各1例，Ⅲ期組織標(biāo)本2例，予以混合RNA，用于初步篩查，利用Human TGF-β/BMP Signaling PathwayPCR Array標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測信號通路84個(gè)基因的突變差異情況。
　　結(jié)果：
　　1、TGF

6、-β信號傳導(dǎo)通路超家族差異基因的篩選和驗(yàn)證
　　對臨床Wilms Tumor組織標(biāo)本提取的總RNA數(shù)量、質(zhì)量及完整性進(jìn)行檢測，結(jié)果符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。
　　Human TGF-β/BMP Signaling Pathway PCR Array標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測TGF-β信號傳導(dǎo)通路超家族中84個(gè)基因的突變差異情況，初步篩選出7個(gè)腫瘤組與癌旁組比較，mRNA表達(dá)量大于10倍的可能的突變差異基因，分別是AMH（抗苗勒氏管激素）（1

7、2.07倍）、BMPR1A（骨形態(tài)生成蛋白1A型受體）(27.15倍)、CHRD（腱蛋白）（43.40倍）、COL1A2（Ⅰ型膠原）（10.45倍）、GDF2（生長分化因子2）（27.84倍）、IGF（胰島素樣生長因子1）（14.54倍）、NROB1（核受體家族）（11.18倍）。
　　RT-PCR方法在28例Wilms Tumor病人的腫瘤組織和癌旁腎組織中驗(yàn)證的結(jié)果是BMPR1A(p=0.036＜0.05)和NROB1(p=0

8、.039＜0.05)是突變的差異基因。
　　2、BMPR1A基因表達(dá)與Wilms Tumor病人臨床病理資料的相關(guān)性分析
　　BMPR1A基因的表達(dá)在臨床病理資料各因素內(nèi)（性別、年齡、分期、侵襲和轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、病理類型）比較，P均大于0.05，各組內(nèi)沒有明顯差異。
　　3、SK-NEP-1人腎母細(xì)胞瘤在不同氧濃度下細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)評估
　　在正常組中，腫瘤細(xì)胞顯示多邊形，排列規(guī)則緊密。在低氧誘導(dǎo)組中，腫瘤細(xì)胞顯示橢

9、圓形或紡錘形，排列松散且不規(guī)則。
　　4、缺氧誘導(dǎo)組及正常組人Wilms Tumor SK-NEP-1細(xì)胞HIF-1α mRNA水平的比較
　　對SK-NEP-1人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株培養(yǎng)的正常組及缺氧誘導(dǎo)組中分別提取RNA數(shù)量、質(zhì)量及完整性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。
　　RT-PCR檢測結(jié)果顯示缺氧誘導(dǎo)組（6.36±0.76）中HIF-1α mRNA表達(dá)水平明顯上升，并且顯著高于正常組(2.69±0.86)

10、(p＜0.05)。
　　5、缺氧誘導(dǎo)組及正常組上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白水平表達(dá)的比較
　　利用Western blotting方法分別檢測HIF-1α、Vimentin、E-cadherin及Actin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示HIF-1α和Vimentin的蛋白水平在缺氧誘導(dǎo)組中明顯上升并高于正常組（0.96±0.15 vs0.51±0.06;1.01±0.13 vs0.81±0.06，p＜0.05），而E-cadher

11、in的蛋白水平在缺氧誘導(dǎo)組中下降并明顯低于正常組(1.03±0.13 vs1.15±0.11，p＜0.05)。
　　6、缺氧誘導(dǎo)組和正常組SK-NEP-1人Wilms Tumor細(xì)胞侵襲性和遷移性能力
　　利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲性實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果:兩組WT細(xì)胞數(shù)目檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種膠膜中腫瘤細(xì)胞數(shù)在缺氧誘導(dǎo)組中顯著高于正常組。(P＜0.05)
　　討論：
　　1、利用PCR芯片的方法在臨床腎母細(xì)胞瘤腫

12、瘤組織標(biāo)本中篩選出TGF-β信號傳導(dǎo)通路超家族中突變差異基因?yàn)锽MPR1A和NROB1
　　TGF-β/BMP信號傳導(dǎo)通路PCR芯片檢測并在大樣本中驗(yàn)證出突變差異基因?yàn)锽MPR1A和NROB1。
　　BMPR1A(骨形態(tài)生成蛋白1A型受體)基因位于人染色體10q23，又稱ALK3。它在TGF-β信號傳導(dǎo)通路超家族中屬于TGF-β細(xì)胞因子超家族受體的類別。文獻(xiàn)證實(shí)在乳腺腫瘤中，BMPR1A的缺乏不僅影響腫瘤細(xì)胞增殖的啟動(dòng)，而且

13、會影響腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，其高表達(dá)會明顯增加乳腺癌的侵襲性。利用小鼠敲除BMPR1A模型能夠證實(shí)干預(yù)BMP的受體能夠給治療高分期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤更好的幫助。miR-656能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長和進(jìn)展，是通過抑制BMPR1A的表達(dá)。
　　而在本研究中，BMPR1A基因mRNA在WT腫瘤組織中明顯升高，可以說明其在Wilms Tumor的發(fā)生和進(jìn)展中起到了重要作用，進(jìn)而影響了TGF-β信號傳導(dǎo)通路超家族在腫瘤中的作用，可能促進(jìn)了

14、腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。但是具體的的影響機(jī)制不明確，是否對其進(jìn)行干預(yù)能夠延緩腫瘤的生長等還有待進(jìn)一步的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
　　NROB1目前與腫瘤的相關(guān)研究較少，擬進(jìn)一步明確表達(dá)的臨床相關(guān)性后再對NROB1的表達(dá)升高與Wilms Tumor關(guān)系進(jìn)行討論。
　　2、TGF-β/BMP信號傳導(dǎo)通路超家族突變差異基因BMPR1A表達(dá)的增加與臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)分析暫時(shí)無明顯意義，需要進(jìn)一步增加病例數(shù)后明確相關(guān)關(guān)系
　　我們對

15、病人的術(shù)前信息、術(shù)后腫瘤的分期、侵襲和轉(zhuǎn)移（淋巴結(jié)、輸尿管、腎盂、腎內(nèi)和腎外血管）、復(fù)發(fā)和病理類型（預(yù)后良好型和預(yù)后差型），分別和BMPR1A mRNA的檢測量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析的比較。結(jié)果顯示BMPR1AmRNA升高在這些臨床因素中沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　這可能與本次研究的病例數(shù)不足有關(guān)，應(yīng)該聯(lián)合多家中心，擴(kuò)大病例數(shù)。增加比較的因素，如存活率和無瘤存活率等，可能可以找到有價(jià)值的臨床意義。
　　3、缺氧誘導(dǎo)條件下腎母細(xì)胞瘤

16、腫瘤SK-NEP-1細(xì)胞生長的模型是研究HIF-1α的一個(gè)很好的體外模型
　　4、HIF-1α在人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)模型中是通過介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用
　　缺氧微環(huán)境能夠上調(diào)人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞表達(dá)HIF-1α，促進(jìn)了該腫瘤細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變，提高了其組織侵襲性和遷移性的能力。Vimentin蛋白表達(dá)的上調(diào)和E-cadherin蛋白的下調(diào)也提示腫瘤細(xì)胞的EMT

17、能夠促進(jìn)其轉(zhuǎn)移。如果能夠通過阻斷HIF-1α下游信號通路的傳導(dǎo)來改善腫瘤微環(huán)境，這樣可能是一個(gè)有效抑制腫瘤侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的方案。盡管這需要明確更多的機(jī)制和進(jìn)一步的研究，但是這能夠給我們控制腫瘤的快速生長和轉(zhuǎn)移提供了思路，給一些臨床病人的手術(shù)治療帶來更多的希望。
　　結(jié)論：
　　1、腎母細(xì)胞瘤中TGF-β信號傳導(dǎo)通路超家族中突變差異基因?yàn)锽MPR1A和NROB1。BMPR1A表達(dá)的增加暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)與臨床病理學(xué)因素有相關(guān)性，需要進(jìn)