白腐菌多功能過氧化物酶Ca2+結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)功能研究.pdf

1、目的:多功能過氧化物酶(VP)是一種主要來源于側(cè)耳菌屬（Pleurotus）和煙管菌屬(Bjerkandera)的可以氧化多種底物的氧化還原酶類。所以多功能過氧化物酶有很好的應(yīng)用前景，它不但可以氧化木質(zhì)素和染料，還可以氧化降解多種藥物使其降解為無毒或低毒物質(zhì)以減弱這些藥物對(duì)環(huán)境和人體的危害。但是由于這種酶在氧化環(huán)境、高溫環(huán)境及過酸過堿環(huán)境中極不穩(wěn)定而限制其實(shí)際應(yīng)用。多功能過氧化物酶的兩個(gè)結(jié)構(gòu)鈣離子對(duì)于維持酶的活性和穩(wěn)定性有很大的作用。參

2、與構(gòu)成多功能過氧化物酶兩個(gè)鈣離子結(jié)合區(qū)的氨基酸對(duì)酶的性質(zhì)的影響，特別是針對(duì)近端鈣離子結(jié)合區(qū)的相關(guān)研究較少。本研究擬通過對(duì)多功能過氧化物酶兩個(gè)鈣離子結(jié)合區(qū)氨基酸的定點(diǎn)突變來闡明其結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性的關(guān)系
　　研究方法:在本研究中，將經(jīng)密碼子優(yōu)化的多功能過氧化物酶基因克隆至pET-32a和pPICZαA表達(dá)載體中并在pET-32a載體上構(gòu)建了多功能過氧化物酶兩個(gè)鈣離子結(jié)合區(qū)共9個(gè)氨基酸的定點(diǎn)突變體(D48A、G60S、D62A、S64A、S

3、170A、D187A、T189A、V192T和D194A)。然后將pPICZαA-VP電轉(zhuǎn)至畢赤酵母中以甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并將野生型多功能過氧化物酶(pET-32a-VP)和各突變體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中在IPTG的誘導(dǎo)及血紅素存在的條件下過表達(dá)并對(duì)其酶學(xué)相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目包括比酶活、酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、酶反應(yīng)的最適pH值、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、鈣離子含量及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。比酶活的檢測(cè)底物包括ABTS、RB5、VA及Mn2+。

4、
　　結(jié)果:1.經(jīng)雙酶切、菌落PCR及測(cè)序顯示pPICZαA-VP、pET-32a-VP及各突變體構(gòu)建成功。2.盡管嘗試不同誘導(dǎo)表達(dá)條件，多功能過氧化物酶在畢赤酵母中的表達(dá)均未成功，SDS-PAGE分析顯示無目的蛋白條帶。3.多功能過氧化物酶及各突變體在E.coli中表達(dá)成功，經(jīng)Ni柱純化后得到高純度的酶液。4.除了近端鈣離子結(jié)合區(qū)的突變體S170A、S170D和V192T外，幾乎所有的突變體都完全喪失活性。5.與野生型VP相比，

5、S170A、S170D和V192T的最適pH值都從3.0偏移至3.5。6.WT VP、S170A、S170D及V192T的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性關(guān)系與其比酶活相類似:WT VP＞V192T＞S170A＞S170D。7.鈣離子濃度檢測(cè)顯示，WT VP平均每個(gè)酶分子包含兩個(gè)鈣離子;而以S170A為代表的活性部分喪失的突變體平均每個(gè)酶分子含有1.5個(gè)鈣離子;以D48A和D187A為代表的活性幾乎完全喪失的突變體平均每個(gè)酶分子含有1.1個(gè)和0.7