利用T-DNA標(biāo)簽法誘變洋桔梗的研究.pdf

1、洋桔梗(Eustoma grandiflorum)是目前世界上較為流行的切花，是十大切花種類之一。我國大陸地區(qū)對洋桔梗的引種較晚，很多地方還處于試驗(yàn)種植階段，至今仍未報(bào)道有新品種的育成。T-DNA標(biāo)簽法，其插入的位點(diǎn)可以貫穿整個(gè)基因組，甚至達(dá)到飽和，幾乎可以標(biāo)簽到所有的基因。因此使用T-DNA標(biāo)簽法可誘導(dǎo)洋桔梗進(jìn)行突變并進(jìn)行基因功能的研究。 本研究以洋桔梗(Eustoma grandiflorum)“Double Mariach

2、i Pink”品種為試材，對其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行了優(yōu)化，為利用T-DNA標(biāo)簽法研究洋桔梗突變建立了高效的轉(zhuǎn)化體系，通過本研究建立的抗性篩選體系成功構(gòu)建了突變庫，為有價(jià)值的變異株系的獲得或基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究建立了洋桔梗ISSR最佳反應(yīng)體系，并對不同株系洋桔梗進(jìn)行了ISSR分子鑒定。 首先，本研究以洋桔梗葉片為外植體，在“三刀切”切割方式的基礎(chǔ)上，對外植體農(nóng)桿菌侵染的共培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明：共培養(yǎng)5

3、d、6d的葉片在轉(zhuǎn)化率和獲得抗性苗數(shù)上沒有顯著差異，但明顯高于其他梯度，因此確立共培養(yǎng)天數(shù)為5d，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到57.7％。GUS瞬間表達(dá)檢測的結(jié)果也支持上述結(jié)論：3d預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和5d共培養(yǎng)時(shí)間，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋桔?！叭~盤法”轉(zhuǎn)化效率最高。同時(shí)，本研究運(yùn)用了一種新的葉片切割方法——“刺孔法”，與傳統(tǒng)的“三刀切”進(jìn)行了再生效率和轉(zhuǎn)化效率的比較，結(jié)果顯示：“刺孔法”切割方式處理的葉盤，平均每對葉塊再生芽數(shù)達(dá)到了23.36個(gè)，明顯高于“三刀切”

4、的19個(gè)：“刺孔法”基礎(chǔ)上農(nóng)桿菌侵染效率和每葉轉(zhuǎn)化數(shù)分別達(dá)到了77.7％和0.64個(gè)，明顯高于“三刀切”的57.7％和0.38個(gè)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋桔?！叭~盤法”高效轉(zhuǎn)化體系的建立，為T-DNA標(biāo)簽法誘變洋桔梗構(gòu)建了良好的受體系統(tǒng)和技術(shù)平臺(tái)。 其次，本研究根據(jù)洋桔?！皾撎硬欢ㄑ俊陛^多的情況，建立了適合于篩選洋桔?？剐栽偕康暮Y選體系。通過生根篩選后得到89個(gè)生長良好的抗性洋桔梗再生株系，對其中挑選的13個(gè)株系進(jìn)行PCR鑒定和GUS表

5、達(dá)檢測，得到8個(gè)PCR陽性株系和4個(gè)GUS表達(dá)陽性株系，PCR陽性株系占隨機(jī)選用株系總體的61.5％，初步確定T-DNA已轉(zhuǎn)入上述株系中，為后期有價(jià)值變異株系的獲得和相應(yīng)基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。 再次，本研究利用正交實(shí)驗(yàn)建立了洋桔梗ISSR最佳反應(yīng)體系：含10×Buffer(Mg2+free)，Mg2+濃度為1.5mmol/L，dNTPs濃度為0.3mmol/L，引物濃度為0.21μmol/L，模板濃度為30ng，Tag DN