小鼠胰島細胞中煙酸受體檢測及其功能研究.pdf

1、本文圍繞小鼠胰島細胞上發(fā)現(xiàn)的煙酸受體,并研究煙酸通過其受體傳導(dǎo)的信號對胰島素分泌的影響來解釋煙酸與糖尿病病人血糖控制的關(guān)系。論文的主要工作概括如下:
　　首先進行定量PCR檢測煙酸受體PUMA-G在小鼠胰島細胞上的轉(zhuǎn)錄水平。由于PUMA-G基因只有一個外顯子,因此以沒有經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的RNA被用作陰性對照。結(jié)果顯示PUMA-G基因在小鼠胰島上有較高的轉(zhuǎn)錄水平。分別取小鼠腹下脂肪和脾臟組織作為陽性對照,發(fā)現(xiàn)PUMA-G在小鼠胰島細胞上的

2、轉(zhuǎn)錄水平和脂肪組織相當(dāng),略高于其在脾臟組織的轉(zhuǎn)錄水平。同時,發(fā)現(xiàn)了PUMA-G在小鼠胰腺組織的腺泡細胞中轉(zhuǎn)錄水平非常低,而小鼠胰島細胞系(NIT-1,Min-6)中PUMA-G基因的轉(zhuǎn)錄,依然只有比較低的轉(zhuǎn)錄水平。
　　由于PUMA-G基因在小鼠胰島細胞上有較高水平的轉(zhuǎn)錄,我們進一步研究了通過PUMA-G介導(dǎo)的信號通路與小鼠胰島素分泌的關(guān)系。其中包括兩種重要的信號分子:Ca2+和cAMP。我們發(fā)現(xiàn)用煙酸作為配體激活PUMA-G蛋白

3、受體介導(dǎo)的信號通路,對胰島細胞胞內(nèi)Ca2+的濃度不起作用。但存在IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)或Forskolin的情況下,胰島細胞內(nèi)cAMP的生成受到抑制,從而減少胰島素的分泌。用PTX(百日咳毒素)處理胰島細胞24h后,PUMA-G受體失活,煙酸對cAMP抑制作用明顯降低,對胰島素分泌水平的抑制也隨之減弱。而且煙酸對cAMP的抑制作用隨著煙酸濃度的增加而越來越明顯。因此,可以認為煙酸通過刺激PUMA-G受體抑制小鼠胰島細胞內(nèi)

4、cAMP的生成,從而降低了胰島素的分泌。
　　為了更直接地研究PUMA-G基因在小鼠胰島細胞上的功能,用分子克隆的方法將PUMA-G基因連接在pEGFP-N1(綠色熒光蛋白)載體上。將帶有PUMA-G基因的質(zhì)粒通過電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的辦法導(dǎo)入小鼠胰島細胞系NIT-1,PUMA-G蛋白和EGFP蛋白共同表達形成融合蛋白。發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入PUMA-G質(zhì)粒使NIT-1細胞膜表面呈綠色,而對照組導(dǎo)入空載體的NIT-1細胞胞漿為綠色。表明PUMA-

5、G蛋白成功地在NIT-1細胞內(nèi)被高水平地表達,并定位在細胞膜上,為進一步研究PUMA-G基因在小鼠胰島細胞中的功能打下了基礎(chǔ)。
　　有研究表明在胰腺切除及再生的過程中,伴隨著一些基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,其中不乏影響胰腺再生的功能基因。由于胰腺切除后小鼠體內(nèi)的酮體(主要成分為3-羥基丁酸)濃度升高,而3-羥基丁酸為PUMA-G受體在小鼠體內(nèi)天然存在的配體,因此,通過研究PUMA-G受體在小鼠胰腺切除及再生的過程中轉(zhuǎn)錄水平的變化。我們發(fā)現(xiàn)