香青蘭黃酮成分的藥代動(dòng)力學(xué)特征及代謝機(jī)理研究.pdf

1、香青蘭在維吾爾醫(yī)學(xué)和民間用于治療冠心病及高血壓等疾病。香青蘭總黃酮是從維藥香青蘭中提取純化制備的黃酮有效部位，具有抗氧化，抗心肌缺血，治療冠心病，心絞痛的等作用。田薊苷是香青蘭總黃酮有效部位的主要的黃酮成分，是其有效成分之一，具有抗炎和降壓作用。本論文通過(guò)采用多種指標(biāo)成分研究香青蘭總黃酮的藥代動(dòng)力學(xué)以及黃酮代謝情況，包括葡萄糖醛酸苷的甲基化代謝，為中藥黃酮類有效成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供新的思路，豐富黃酮類化合的代謝途徑，同時(shí)也為香青蘭總

2、黃酮的新藥開(kāi)發(fā)和劑型改進(jìn)提供依據(jù)。
　　一、UPLC-DAD-QTOF分析香青蘭總黃酮有效部位在大鼠體內(nèi)的黃酮代謝輪廓
　　采用UPLC-DAD-QTOF的方法，指認(rèn)了香青蘭黃酮有效部位中的15個(gè)黃酮成分;其主要是黃酮類(flavones)，其基本結(jié)果如圖a，如acacetin(Aca)，apigenin(Api)，luteolin(Lut)，diosmetin(Dio)及其葡萄糖苷或葡萄糖醛酸苷。這些黃酮化合物都含有兩個(gè)以

3、上的酚羥基，主要有5-，7-，3'-和4'-羥基。Tilianin(Til),luteolin7-glucuronide(Lut-7-G),apigenin7-glucuronide(Api-7-G),acacetin7-glucuronide(Aca-7-G),Api,Aca,luteolin7-glucoside(Lut-7-Glc)，Lut和Dio在香青蘭總黃酮中被指認(rèn)，其含量分別是7.3％，3.8％，1.1％，1.0％，0.08

4、9％，0.17％，0.45％，0.14％和0.30％(w/w)。在總黃酮中含量最高的是刺槐素的糖苷（Til和Aca-7-G），其次是木犀草素的糖苷（Lut-7-G和Lut-7-Glc）和芹菜素的糖苷（Api-7-G）。
　　該有效部位的黃酮類化合物主要是具有多個(gè)酚羥基的黃酮類，為闡述清楚口服給予香青蘭總黃酮有效部位的血漿黃酮代謝輪廓圖，建立了聯(lián)合多種方法鑒別葡萄糖醛酸苷結(jié)合位點(diǎn)的策略，包括黃酮苷的的高分辨率質(zhì)譜的測(cè)定以及柱后添加金

5、屬絡(luò)合試劑CoBr2和輔助配體（4，7-二苯基-1，10-菲咯啉）形成的絡(luò)合物[Co(Ⅱ)(黃酮苷-H)（4，7-二苯基-1，10-菲咯啉）2]+質(zhì)譜分析和與酶合成的黃酮葡萄糖醛酸苷的對(duì)照品（葡萄糖醛酸結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)UV光譜漂移的方法鑒別）的保留時(shí)間比對(duì)，判別血漿中黃酮葡萄糖醛酸苷的結(jié)合位點(diǎn)。該策略成功應(yīng)用于灌胃給予香青蘭總黃酮有效部位的血漿黃酮代謝輪廓圖研究，鑒別血漿中不同取代位置的葡萄糖醛酸黃酮苷12個(gè)，分別是Aca，Api，Lut，

6、Dio，chrysoeriol(Chr)和cirsimaritin(Cir)的單葡萄糖醛酸苷。即Aca-7-G，Aca-5-G，Api-5-G，Api-7-G，Lut-7-G,Lut-3'-G, Lut-4'-G,Dio-7-G,Dio-3'-G,Chr-4'-G,Cir-4'-G和Dio-5-G/Chr-5-G。
　　首次建立的香青蘭總黃酮在體內(nèi)的黃酮代謝輪廓圖，鑒定24個(gè)黃酮化合物，其中入血成分10個(gè)，14個(gè)黃酮代謝產(chǎn)物。在體

7、內(nèi)黃酮結(jié)構(gòu)上3'-和7-的羥基易與葡萄糖醛酸結(jié)合成苷。根據(jù)灌胃給予香青蘭總黃酮有效部位的血漿黃酮代謝輪廓圖和香青蘭總黃酮中主要黃酮的含量，選擇Til，Aca-7-G，Lut-3'-G，Api-7-G，Api和Aca六個(gè)黃酮成分為香青蘭總黃酮有效部位SD大鼠口服藥代動(dòng)力學(xué)的pharmacokinetic markers。
　　二、香青蘭總黃酮有效部位在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　建立了同時(shí)檢測(cè)血漿中Til，Aca-7-G，L

8、ut-3'-G，Api-7-G，Api和Aca的UPLC-MS/MS的定量分析方法，采用甲醇從血漿中提取待分析化合物，除去血漿中的蛋白。應(yīng)用該方法研究了香青蘭總黃酮有效部位在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，繪制了灌胃給予400 mg/kg，200 mg/kg和100 mg/kg的三個(gè)劑量組的SD大鼠血漿藥物濃度-時(shí)間曲線，采用非房室模型計(jì)算主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Winnolin3.3)，評(píng)價(jià)SD大鼠給藥后香青蘭黃酮在體內(nèi)的動(dòng)力特征，Til，Aca

9、-7-G，Api-7-G，Api和Aca快速被吸收，Aca-7-G在血漿中的暴露量大于其他黃酮苷的，其次是Lut-3'-G;而香青蘭總黃酮有效部位中的較多的Lut-7-G，在血漿中很少，而以Lut-3'-G暴露。香青蘭總黃酮藥動(dòng)學(xué)呈非線性動(dòng)力學(xué)特征。這可能是由于香青蘭總黃酮給藥劑量達(dá)到一定限度時(shí)，體內(nèi)Ⅱ相代謝酶的催化能力和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力達(dá)到飽和，血藥濃度的變化不呈現(xiàn)劑量依賴性。SD大鼠灌胃給藥后的Til絕對(duì)生物利用度在高、中、低三個(gè)

10、劑量組分別平均為1.63％，0.45％，0.24％。
　　三、Tilianin在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　建立了同時(shí)檢測(cè)血漿中Til，Aca-7-G，acacetin-7-sulfate（Aca-7-S）和Aca的UPLC-MS/MS的定量分析方法，符合生物的樣品分析方法驗(yàn)證的要求，采用甲醇從血漿中提取待分析化合物，除去血漿中的蛋白。應(yīng)用該方法研究了香青蘭總黃酮有效部位中含量最多的成分——Til在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。繪

11、制了灌胃給予30 mg/kg和15 mg/kg的兩個(gè)劑量組和尾靜脈給藥組(0.3 mg/kg)的SD大鼠血漿藥物濃度-時(shí)間曲線，采用非房室模型計(jì)算主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Winnolin3.3)，評(píng)價(jià)SD大鼠給藥后Til，Aca-7-G，Aca-7-S和Aca在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)特征。Til和Aca在血漿中濃度比較低，而血漿中主要代謝物Aca-7-G和Aca-7-S的血藥濃度比較高，約9h達(dá)峰;而Aca-7-G在香青蘭總黃酮有效部位的藥代動(dòng)力學(xué)

12、研究中，達(dá)峰時(shí)間為20 min，達(dá)峰時(shí)間顯著的差異(P＜0.05)，這個(gè)現(xiàn)象可能與Til，Aca和Aca-7-G在體內(nèi)的三個(gè)循環(huán)（即肝腸循環(huán)，腸腸循環(huán)和腸局部循環(huán)）有關(guān)。采用灌胃給予Aca(10mg/kg)后，Aca-7-G的達(dá)峰時(shí)間也在9h左右，也驗(yàn)證了三個(gè)循環(huán)導(dǎo)致大量的Aca-7-G外排至腸腔，隨腸道蠕動(dòng)至結(jié)腸，被細(xì)菌水解成Aca，再次被吸收代謝成Aca-7-G入血。
　　四、Luteolin7-glucuronide的甲基化

13、代謝研究
　　采用鼠肝S9的孵育體系研究Lut-7-G的甲基化代謝，其中S9是兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶源，S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，反應(yīng)在37℃的磷酸鹽緩沖液(5 mM，pH7.8)中進(jìn)行，一段時(shí)間后加入冰冷含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液終止反應(yīng)。Lut-7-G在體外的甲基化反應(yīng)體系中，產(chǎn)生了兩個(gè)甲基化產(chǎn)物，通過(guò)QTOF的鑒別分別是Dio-7-G和Chr-7-G。Lut和Lut-7-G在三不同濃度（1，5和10μM）甲基化速率比較中，都傾向

14、于4'位即對(duì)位甲基化，在鼠肝S9中，Lut-7-G更容易甲基化生成Dio-7-G，而其甲基化速率比Lut的甲基化速率慢(P＜0.05)，且約為L(zhǎng)ut甲基化速率的1/2-2/3。使用鼠肝微粒UGT孵育體系研究Dio和Chr的葡萄糖醛酸化代謝（對(duì)于Dio底物濃度范圍選擇0.3125-80μM，孵育時(shí)間30 min;對(duì)于Chr底物濃度范圍選擇0.3125-15μM，孵育時(shí)間30 min），采用米氏方程或其他方程擬合，發(fā)現(xiàn)3'和4'易于被UGT

15、代謝。
　　在膽道插管大鼠實(shí)驗(yàn)中，灌胃給予Lut(4.7 mg/kg)之后，通過(guò)插管收集膽汁，采用UPLC-MS/MS分析，發(fā)現(xiàn)膽汁中存在大量的Lut-3，-G，Lut-7-G，Chr-7-G和Dio-7-G而Chr-4'-G和Dio-3'-G未檢測(cè)到。由可知此體內(nèi)的Chr-7-G和Dio-7-G可能不是由Lut先被甲基化，生成Dio和Chr，然后再葡萄糖醛酸化產(chǎn)生，而是主要由Lut先被葡萄糖醛酸化生成Lut-7-G，然后甲基化生

16、成。因此甲基化代謝可能是機(jī)體處置兒茶酚類葡萄糖醛酸苷的一種重要代謝途徑。
　　結(jié)論:本文首次采用聯(lián)合多種鑒別黃酮葡萄糖醛酸苷結(jié)合位點(diǎn)方法的策略，分析灌胃給予香青蘭總黃酮有效部位的血漿黃酮代謝輪廓，成功地鑒別血漿中不同取代位置的葡萄糖醛酸黃酮苷12個(gè)。首次建立香青蘭總黃酮在體內(nèi)的黃酮代謝輪廓圖，鑒定24個(gè)黃酮化合物，其中入血成分10個(gè)，14個(gè)黃酮代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)黃酮結(jié)構(gòu)上3'-和7-的羥基易與葡萄糖醛酸結(jié)合成苷。將灌胃給予香青蘭總黃

17、酮有效部位的血漿黃酮代謝輪廓圖，應(yīng)用于香青蘭黃酮在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究，考察了Til，Aca-7-G，Lut-3'-G，Api-7-G，Api和Aca在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)Til在大鼠的生物利用度低，但是香青蘭總黃酮中的Til的生物利用度比純品的生物利用度高，血漿中暴露的Aca-7-G和Lut-3，-G較其他黃酮苷多，香青蘭總黃酮藥動(dòng)學(xué)呈非線性動(dòng)力學(xué)特征。本文通過(guò)Til在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究，考察了Til，Aca-7-G，