(氧化)苦參堿與去甲烏藥堿藥代動(dòng)力學(xué)特征與代謝機(jī)理.pdf

1、一、背景與目的:
　　 有毒中藥的毒性和有效性均可反映為有毒中藥的藥代動(dòng)力學(xué)特征。從藥代動(dòng)力學(xué)的角度，認(rèn)識(shí)有毒中藥的毒性特點(diǎn)，并從藥物代謝等影響藥代動(dòng)力學(xué)特征的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和分子靶點(diǎn)認(rèn)識(shí)有毒中藥的安全性和有效性，可為臨床合理駕馭有毒中藥的毒性提供依據(jù)?；诖耍菊撐闹饕x擇了山豆根有效成分及附子、細(xì)辛共同的有效成分為主要研究對(duì)象，從藥代動(dòng)力學(xué)和代謝關(guān)鍵環(huán)節(jié)上開展研究工作。
　　 山豆根是越南槐(Sophora tonkine

2、nsis)的干燥根莖，主要分布在中國(guó)的西南部，臨床作為一種常用中藥用于治療黃疸，炎癥，腫痛。氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)與苦參堿(matrine，MT)是山豆根中最主要的有效成分，也是有毒成分，是研究山豆根的代表性化合物，它們具有抗炎，抗腫瘤，抗乙肝病毒的作用。山豆根提取物具有良好的藥理活性，同時(shí)也具有一定的副作用與肝臟毒性。研究報(bào)道關(guān)于氧化苦參堿與苦參堿的治療作用與潛在毒性的討論較多?？茖W(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，氧化苦參堿與苦參堿

3、均是主要的毒性生物堿，其中苦參堿主要有神經(jīng)毒性的作用。而氧化苦參堿向苦參堿的轉(zhuǎn)化是造成血中氧化苦參堿濃度低與苦參堿濃度高的主要原因，這種轉(zhuǎn)換可以影響氧化苦參堿與苦參堿的療效與毒性，目前這種轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本論文以oxymatrine與matrine為目標(biāo)化合物，研究對(duì)比了山豆根提取物與氧化苦參堿純品藥代動(dòng)力學(xué)特征，及氧化苦參堿生物轉(zhuǎn)化的機(jī)理。
　　 附子、細(xì)辛中的主要有效成分之一去甲烏藥堿（Higenamine），

4、具有強(qiáng)心與抗炎的作用，在我國(guó)去甲烏藥堿現(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床研究。但其安全性評(píng)價(jià)仍然存在巨大挑戰(zhàn)。其中可直接影響去甲烏藥堿藥動(dòng)學(xué)特征與藥效作用的代謝特征缺失。文獻(xiàn)報(bào)道，新西蘭兔靜脈給藥去甲烏藥堿后在尿液中可檢測(cè)到主要有24～33％的去甲烏藥堿葡萄糖醛酸化結(jié)合物，這可能是導(dǎo)致其低生物利用度的原因。因此，我們重點(diǎn)研究了去甲烏藥堿的葡萄糖醛酸化代謝。
　　 因此，本文的研究目的是(1)以氧化苦參堿與苦參堿為特征性標(biāo)志物，比較了單獨(dú)給藥氧

5、化苦參堿單體與單獨(dú)給藥山豆根提取物的藥動(dòng)學(xué)特征差異，為山豆根的毒性預(yù)警和臨床應(yīng)用提供依據(jù);(2)我們猜測(cè)造成山豆根提取物與氧化苦參堿單品藥動(dòng)學(xué)差異的原因是由于氧化苦參堿在體內(nèi)向苦參堿的轉(zhuǎn)化，因此進(jìn)一步研究氧化苦參堿向苦參堿轉(zhuǎn)化的代謝特征與機(jī)理;(3)為探尋去甲烏藥堿低生物利用度的原因及代謝種屬差異對(duì)藥動(dòng)學(xué)的影響，我們基于藥物代謝酶研究去甲烏藥堿的葡萄糖醛酸化代謝特征與代謝機(jī)理，為臨床前研究及臨床安全用藥提供基本的理論基礎(chǔ)。
　　

6、 二、方法:
　　 建立靈敏的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，檢測(cè)口服給藥山豆根提取物與口服，靜脈給藥氧化苦參堿純品大鼠血漿中OMT與MT的濃度，運(yùn)用winnolin3.3進(jìn)行數(shù)據(jù)模擬處理得到藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。運(yùn)用重組人源化CYP亞酶與化學(xué)抑制劑在無氧條件下進(jìn)行體外微粒體孵育模型及高效液相色譜技術(shù)，進(jìn)行氧化苦參堿代謝機(jī)理研究。采用重組人源化UGT亞酶與不同種屬的肝微粒體進(jìn)行體外孵育實(shí)驗(yàn)，研究去甲烏藥堿的UGT代謝機(jī)理。
　　 統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)用mean±SD來表示。統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0.采用統(tǒng)計(jì)方法independent-samples T-test或者One-way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 三、結(jié)果:
　　 1.山豆根提取物中苦參堿(matrine)與氧化苦參堿(oxymatrine)的含量測(cè)定
　　 建立一種靈敏，可靠的HPLC方法測(cè)定山豆根提取物中的氧化苦參堿與苦參堿的含量，為確定藥動(dòng)學(xué)研究中的給藥劑量提供依據(jù)。受試樣

8、品山豆根提取物中氧化苦參堿的含量為0.60％，苦參堿的含量為0.40％。
　　 2.大鼠口服山豆根提取物和OMT單體的藥動(dòng)學(xué)特征參數(shù)及生物利用度評(píng)價(jià)
　　 建立一種靈敏，可靠，快速的UPLC-MS/MS方法來檢測(cè)大鼠血漿中的氧化苦參堿與苦參堿的血藥濃度。大鼠灌胃或尾靜脈給藥后，采用后眼眶取血的方法分別完成大鼠口服給藥山豆根提取物，口服與靜脈給藥氧化苦參堿單體的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，大鼠口服氧化苦參堿單

9、體2 mg/kg與山豆根提取物(相當(dāng)于氧化苦參堿2 mg/kg，苦參堿1.3 mg/kg)后，表現(xiàn)為不同的藥動(dòng)學(xué)行為，Cmax，AUC0→t，以及MRT0→t均有顯著性差異(t-test，p＜0.05)。大鼠口服山豆根提取物與口服氧化苦參堿單體后，血中可發(fā)現(xiàn)大量的苦參堿，氧化苦參堿的絕對(duì)生物利用度分別為1.87％，6.79％，均較低。我們將代謝產(chǎn)物苦參堿計(jì)入后，計(jì)算得到大鼠口服氧化苦參堿單體后，總生物堿(MT+OMT)的生物利用度為81

10、.14±8.83％;口服山豆根提取物后，總生物堿(MT+OMT)的生物利用度為69.36±17.37％。
　　 3.OMT與MT血漿蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)
　　 我們采用操作簡(jiǎn)便，干擾小，省時(shí)高效的超濾法，來研究氧化苦參堿，苦參堿在大鼠血漿中的結(jié)合率。
　　 實(shí)驗(yàn)測(cè)得，氧化苦參堿的血漿蛋白結(jié)合率為4.80％～8.95％，苦參堿的血漿蛋白結(jié)合率為5.10～10.55％，這與之前的藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)中氧化苦參堿與苦參堿的快速消除相一

11、致(靜脈給藥氧化苦參堿與苦參堿的半衰期分別為181.74±31.51 min,249.20±76.21 min)。
　　 4.OMT在人的肝臟與腸道微粒體中代謝生成MT的速率比較
　　 分別運(yùn)用人的肝臟與腸道微粒體，進(jìn)行體外孵育實(shí)驗(yàn)研究OMT在肝臟與腸道中代謝生成MT的酶動(dòng)學(xué)特征，比較OMT在腸道與肝臟中的代謝速率差異。結(jié)果表明，OMT在肝臟中的速率與清除率均大于在腸道中(Vm肝臟1.49±0.24nmol/min/mg

12、＞Vm腸道0.46±0.05 nmol/min/mg，CL肝臟0.0067 ml/min/mg＞CL腸道0.0031 ml/min/mg)。
　　 5.CYP亞酶特異性化學(xué)抑制劑對(duì)OMT代謝生成MT的影響
　　 選用一系列CYP亞酶特異性化學(xué)抑制劑來（CYP1A2抑制劑馬來酸氧氟沙明，CYP2C8抑制劑槲皮素，CYP2C9抑制劑鹽酸胺碘酮，CYP2C19抑制劑奧美拉唑，CYP2D6抑制劑奎尼丁，CYP3A抑制劑酮康唑，C

13、YP2E1抑制劑二乙基二硫代氨基甲酸）研究負(fù)責(zé)參與OMT代謝生成MT的CYP酶亞型。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，加入CYP3A，2C19組的MT生成量均減少(p＜0.05，one wayANOVA)，其中CYP3A組相對(duì)于對(duì)照組減少了50％以上，說明CYP3A主要參與了其代謝過程。
　　 6.人源重組化CYP亞酶純酶實(shí)驗(yàn)
　　 選用人源重組化CYP純酶驗(yàn)證參與OMT代謝生成MT的CYP酶亞型。結(jié)果表明，CYP3A4組的MT生

14、產(chǎn)量顯著高于其他組(CYP1A2，1B1，2D6，2C19，3A5，2C8，2B6，2A6，1A1，2E1)，說明CYP3A4主要負(fù)責(zé)OMT代謝生成MT。
　　 7.去甲烏藥堿(Higenamine)的UGT代謝機(jī)理研究
　　 我們運(yùn)用12種重組人源化UGT亞酶與Higenamine在高、中、低三個(gè)濃度(20μM，40μM，200μM)下進(jìn)行孵育，分別考察它們?cè)诓煌娜薝GT同工酶中的代謝速率的差異。研究表明，UGT1A

15、6，UGT1A8，UGT1A9參與去甲烏藥堿的代謝，代謝速率大小順序?yàn)?UGT1A9＞UGT1A8＞UGT1A6。UGT1 A8最主要存在于人的腸道中，UGT1A6最主要存在于人的肝臟中，UGT1A9則幾乎只在肝臟中表達(dá)，即我們推測(cè)去甲烏藥堿的代謝器官主要是在肝臟和腸道。
　　 與此同時(shí)，運(yùn)用重組人源化UGT亞酶，研究去甲烏藥堿在主要負(fù)責(zé)其葡萄糖醛酸化代謝UGT亞酶中的酶代動(dòng)力學(xué)特征。去甲烏藥堿在UGT1A9中的代謝屬于非經(jīng)典米

16、氏方程中的自身激活型(Autoactivation)，在UGT1A8中的代謝屬于經(jīng)典的米氏方程(Michaelis-Menten equation)。清除率Vmax/Km的大小是UGT1A9(0.0055 ml/min/mg)＞UGT1A8(0.0005 ml/min/mg)。
　　 8.UGT亞酶化學(xué)抑制劑對(duì)去甲烏藥堿(Higenamine)代謝影響的研究
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證參與去甲烏藥堿代謝的UGT酶亞型，我們考察了

17、UGT特異性化學(xué)抑制劑:UGT1A6特異性化學(xué)抑制劑苯基丁氮酮(phenylbutazone)，UGT1A9特異性化學(xué)抑制劑香芹酚(carvacrol)對(duì)去甲烏藥堿在人的肝臟中的葡萄糖醛酸化反應(yīng)的影響。
　　 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，加入carvacrol的UGT1 A9與Human LiverMicrosome(HLM)反應(yīng)體系中代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)量隨著抑制劑濃度的增加而降低(p＜0.05，one way ANOVA)，而加入ph

18、enylbutazone組則沒有該趨勢(shì)。說明UGT1 A9是去甲烏藥堿在肝臟代謝的最主要亞酶，UGT1A6則不是。
　　 9.比較去甲烏藥堿在肝臟與腸道微粒體中的酶代動(dòng)力學(xué)特征的研究
　　 運(yùn)用肝臟與腸道的微粒體，進(jìn)行體外孵育實(shí)驗(yàn)，研究Higenamine在肝臟與腸道中的酶動(dòng)學(xué)特征，比較Higenamine在腸道與肝臟中的代謝速率差異。
　　 結(jié)果表明，Higenamine在肝臟中的反應(yīng)速率(6.81±1.73

19、nmol/min/mg)要大于腸道(1.26±0.30 nmol/min/mg)。
　　 10.去甲烏藥堿在大鼠，小鼠，豚鼠，狗，人的肝微粒體中代謝速率差異的比較及酶動(dòng)學(xué)特征研究
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，去甲烏藥堿在兔，狗，人的藥代動(dòng)力學(xué)特征差異較大，我們猜測(cè)這可能是由于它的代謝差異造成的。為驗(yàn)證此假說，我們運(yùn)用五種不同種屬（大鼠，小鼠，豚鼠，狗，人）不同性別的肝微粒體研究Higenamine的葡萄糖醛酸化代謝速率與酶動(dòng)學(xué)特

20、征的差異。
　　 結(jié)果表明，Higenamine在五種不同種屬的肝微粒體中的代謝速率與酶動(dòng)學(xué)特征均存在顯著性差異。Higenamine在雄性與雌性大鼠，小鼠的肝微粒體中的葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)為底物抑制型(Substration inhibition);在雌性及雄性的豚鼠，狗，人的肝微粒體中的代謝屬于自身激活型(Autoactivation)。狗與人的葡萄糖醛酸化的酶代動(dòng)力學(xué)特征最為接近，提示我們?cè)诮窈竽M人體代謝的研究中可選用狗

21、為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　　 與此同時(shí)，我們研究了性別差異對(duì)去甲烏藥堿葡萄糖醛酸化代謝的影響。結(jié)果表明，除了大鼠存在顯著性的性別差異及狗在中濃度和高濃度存在顯著性差異外，豚鼠，小鼠，人的去甲烏藥堿葡萄糖醛酸化代謝無明顯性別差異。
　　 四、結(jié)論:
　　 1.大鼠口服氧化苦參堿單體2mg/kg與山豆根提取物(相當(dāng)于氧化苦參堿2mg/kg，苦參堿1.3 mg/kg)后，在血中發(fā)現(xiàn)均以苦參堿存在形式為主，且表現(xiàn)為不同的藥動(dòng)學(xué)行為

22、，Cmax，AUC0→t，以及MRT0→t均有顯著性差異(t-test，p＜0.05);氧化苦參堿的絕對(duì)生物利用度分別為1.87％，6.79％，均較低，我們猜測(cè)造成這兩種生物利用度差異的原因可能是山豆根中的其他成分可能影響氧化苦參堿向苦參堿的轉(zhuǎn)化過程;為闡明藥動(dòng)學(xué)差異的原因，進(jìn)一步探尋該轉(zhuǎn)化機(jī)理，發(fā)現(xiàn)OMT發(fā)生轉(zhuǎn)化的器官在肝臟，OMT發(fā)生(Ⅰ0相還原反應(yīng)生成MT,且反應(yīng)主要由CYP3A4介導(dǎo)，這一轉(zhuǎn)化過程直接影響了山豆根主要成分的生物利