胞外的熱休克蛋白90α介導(dǎo)屋塵螨導(dǎo)致的支氣管上皮屏障破壞過程及其機(jī)制的探討.pdf

1、支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是多種細(xì)胞成分和細(xì)胞組分參與的持續(xù)的慢性氣道炎癥性疾病。氣道屏障的破壞和高通透性是哮喘發(fā)病的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。既往研究表明屋塵螨(HDM)能增加氣道上皮屏障的通透性，從而參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。然而，其具體機(jī)制尚不明確。熱休克蛋白(Hsp)90α通過分泌到細(xì)胞外的微環(huán)境（簡(jiǎn)稱胞外）而發(fā)揮其促細(xì)胞動(dòng)力作用，目前的研究主要集中在傷口的愈合和腫瘤的轉(zhuǎn)移。RhoA信號(hào)是生物體內(nèi)重要的信號(hào)，參與了血管內(nèi)皮及腸道的屏障的破壞，抑制Hsp9

2、0可通過破壞src調(diào)節(jié)的RhoA信號(hào)保護(hù)內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的肺內(nèi)皮細(xì)胞的屏障破壞。因此，胞外的Hsp90α(eHsp90α)可能在HDM誘導(dǎo)的氣道上皮屏障破壞中扮演十分重要的作用，同樣，體外研究也進(jìn)一步表明了抑制表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)（EGFR信號(hào)）可明顯改善HDM所導(dǎo)致的氣道上皮高通透性，但其具體機(jī)制尚不明確。
　　目的:
　　1、探討HDM誘導(dǎo)的氣道上皮屏障破壞的具體機(jī)制和eHsp90α通過激活RhoA/肌球蛋白輕鏈(M

3、LC)介導(dǎo)HDM誘導(dǎo)的支氣管上皮屏障的破壞。
　　2、探討HDM對(duì)肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維(F-actin)重新排布的影響及EGFR信號(hào)在其中的作用。
　　方法:
　　通過測(cè)量跨膜電阻值(TEER)和右旋糖苷的通透率(FITC-DX)來評(píng)估HDM誘導(dǎo)的人支氣管氣道上皮細(xì)胞16HBE14o-(16HBE)的屏障功能的破壞，通過免疫蛋白印記法(Western blotting)和免疫熒光(Cofocal)來評(píng)估粘附連接蛋白E-ca

4、dherin及β-catenin的表達(dá)和分布的情況。通過濃縮和純化條件培養(yǎng)基檢測(cè)氣道上皮細(xì)胞對(duì)eHsp90α的分泌情況。RhoA的活性是通過Rho G-LISA(@)RhoA activation assay kitTM biochem kit試劑盒測(cè)定，通過蛋白免疫印記法測(cè)定MLC磷酸化水平。另外，應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)HDM對(duì)EGFR、磷酸化EGFR及F-actin蛋白水平變化，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察F-acti

5、n的分布變化。
　　結(jié)果:
　　與對(duì)照組相比，HDM刺激16HBE細(xì)胞引起上皮細(xì)胞單層的高通透性，表現(xiàn)為TEER值下降和FITC-DX升高，且均在400U/ml的HDM最明顯。同時(shí)，HDM亦可引起粘附連接蛋白E-cadherin和β-catenin的在細(xì)胞膜上面的分布異常，由細(xì)胞膜向胞漿彌散。另外，HDM刺激16HBE細(xì)胞時(shí)，可以觀察到eHsp90α的分泌是明顯增多，且均在400U/ml的HDM最明顯。
　　進(jìn)一步通過

6、慢病毒下調(diào)Hsp90α及預(yù)處理eHsp90α的單克隆抗體1G6-D7可以保護(hù)HDM誘導(dǎo)的屏障的破壞，表現(xiàn)為TEER和FITC的改善及E-cadherin和β-catenin的分布異常的改善。同時(shí)，400U/ml的HDM作用16HBE細(xì)胞在6h引起RhoA的活性的增加，而同濃度的HDM可引起MLC的磷酸化水平開始6h升高，24h達(dá)最高。然而發(fā)現(xiàn)下調(diào)Hsp90α及預(yù)處理eHsp90α的單克隆抗體1G6-D7可以保護(hù)HDM誘導(dǎo)的RhoA的活性

7、和MLC的磷酸化水平。進(jìn)一步使用Rho激酶的抑制劑GSK429286A和Y276322HC1預(yù)處理16HBE細(xì)胞可以保護(hù)HDM誘導(dǎo)的支氣管上皮屏障的破壞，表現(xiàn)為TEER和FITC的改善及E-cadherin和β-catenin的分布異常的改善。另外，人重組(hr)Hsp90α而不是hrHsp90β刺激16HBE細(xì)胞亦可以誘導(dǎo)支氣管上皮屏障的高通透性及RhoA/MLC信號(hào)的活化。
　　然后，予EGFR抑制劑AG-1478進(jìn)行預(yù)處理，

8、實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組，AG-1478組，HDM組，AG-1478+HDM組。與對(duì)照組比較，HDM組磷酸化EGFR表達(dá)明顯增多，加入EGFR抑制劑AG-1478后E-cadherin和β-catenin的分布異常及TEER值、FITC-DX通透率均明顯改善。HDM刺激后促進(jìn)F-actin表達(dá)增多并出現(xiàn)重新排布，而EGFR抑制劑AG-1478可明顯抑制這一過程。
　　結(jié)論:
　　1、研究證明了eHsp90α通過激活RhoA/ML