中國男性非梗阻性無精子癥全基因組拷貝數(shù)變異和單核苷酸多態(tài)性研究.pdf

1、不孕不育嚴重影響了人類的生殖健康，全球范圍內(nèi)的育齡夫婦中有10％-15％存在生育困難，其中由男性因素導致的約占30-55％。男性不育多是由精子生成障礙導致的，其中原發(fā)性非梗阻性無精子癥(Non-obstructive Azoospermia，NOA)是影響較為嚴重的一種表現(xiàn)形式，其發(fā)病率約占男性總數(shù)的1％，我國的男性不育患者中有近四分之一是NOA導致的。NOA是一種由于無法正常產(chǎn)生精子從而導致射出的精液中不能發(fā)現(xiàn)精子的嚴重影響生殖功能的

2、疾病，臨床上排除輸精管梗阻、逆行或無法射精等原因之后，三次連續(xù)射精的精液中都沒有通過顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)精子的患者被診斷為NOA。在男性不育的諸多影響因素中，遺傳因素約占15-30％。近年來隨著遺傳學研究方法的快速發(fā)展，DNA拷貝數(shù)變異(Copy Number Variations，CNV)逐漸被人們關(guān)注。CNV是一種長度在數(shù)千堿基對(Kb)到數(shù)百萬堿基對(Mb)之間的一種大片段拷貝數(shù)改變引起的結(jié)構(gòu)變異。由于CNV覆蓋的區(qū)域大且通常包含了大量

3、的基因、突變位點以及一些功能性元件，攜帶大量遺傳信息，有研究報道CNV所能解釋的表達差異與SNP解釋的表達差異是相互獨立的，兩者幾乎沒有重疊，提示CNV可以作為SNP研究的互補，肯定了CNV的研究價值。由于目前尚沒有中國人群大樣本的CNV研究，因此本研究第一部分在中國男性NOA患者中開展了全基因組拷貝數(shù)變異研究，并結(jié)合后期獨立樣本的驗證來證實初篩階段發(fā)現(xiàn)的中國人群NOA相關(guān)的拷貝數(shù)變異區(qū)域，促進NOA的防治具有一定的現(xiàn)實意義。
　

4、　全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association study，GWAS)不同于以往的候選基因研究，不需要在研究之前提出病因假設(shè)，該研究是通過高密度芯片來實現(xiàn)大規(guī)模系統(tǒng)性的篩查從而發(fā)現(xiàn)潛在的致病位點。GWAS研究通常采用大樣本對全基因組范圍內(nèi)的單核苷酸變異進行初篩，并輔以多階段多中心的獨立驗證。但GWAS研究也存在一定的局限性，通常僅納入常染色體上的SNP位點，忽略了性染色體上所攜帶的基因信息。在研究男科學疾病時，Y染色

5、體起著性別決定作用，因此對于研究NOA這類男性特有的疾病時，忽略Y染色體上的遺傳信息可能會對NOA的病因?qū)W研究帶來一定程度的影響。“Y染色體單倍群”是針對Y染色體開展的單倍群研究，本課題組前期在東亞人群的研究中發(fā)現(xiàn)Y染色體單倍群K*可能承受更高的男性不育的風險。而Y染色體單倍群O3e*表現(xiàn)出的則是保護作用?；赮染色體功能的多樣性，我們推斷出Y染色體單倍群K*和單倍群O3e*可能伴隨基因調(diào)控原件在精子發(fā)生過程中起著危害或保護作用。

6、>　　作為遺傳背景中一個主要的因素，Y染色體單倍群可能是一些表型的變異，例如SNPs的一個基礎(chǔ)。現(xiàn)有的關(guān)聯(lián)研究僅僅考慮了Y染色體或者僅僅考慮了常染色體，這會導致不同研究人群甚至相同的研究人群結(jié)果的不一致性。因此，為了排除疾病關(guān)聯(lián)分析中遺傳背景的影響，本研究的第二部分主要研究常染色體多態(tài)性位點與NOA關(guān)聯(lián)研究以及常染色體多態(tài)性位點與Y染色體單倍群結(jié)果的交互分析，本研究結(jié)果對于深入闡述人類常染色體多態(tài)性與Y染色體單倍群的交互作用在精子發(fā)生過

7、程中的作用及其可能的遺傳機制有著重要的理論和現(xiàn)實意義，最終為不育癥的診斷和治療提供新的途徑和方法。
　　第一部分 中國男性非梗阻性無精子癥全基因組拷貝數(shù)變異研究
　　本課題組前期曾參與了高加索人群無精子癥全基因組SNPs和CNVs研究，發(fā)現(xiàn)了2名患者存在位于染色體9p24.3區(qū)域的DMRT1基因的拷貝數(shù)缺失，且后期在本課題組提供的中國漢族男性NOA樣本中驗證發(fā)現(xiàn)3名男性存在該基因的拷貝數(shù)缺失。該研究結(jié)果提示DMRT1基因的拷

8、貝數(shù)缺失可能是人類精子發(fā)生障礙的風險因素。由于該項研究的初篩人群為323例高加索無精子癥患者，并不能揭示中國漢族男性的拷貝數(shù)變異情況，因此，本研究第一部分采用大樣本多階段的病例-對照研究設(shè)計，對中國漢族男性進行拷貝數(shù)變異的全基因組關(guān)聯(lián)分析，進一步篩查中國人群無精子癥拷貝數(shù)變異的相關(guān)致病基因，隨后進一步擴大樣本量進行驗證，以期證實初篩階段發(fā)現(xiàn)的中國人群NOA相關(guān)的拷貝數(shù)變異區(qū)域。
　　我們假設(shè)結(jié)構(gòu)重組的熱點區(qū)域是分散在整個基因組的，

9、這些重組熱點區(qū)域會導致罕見的CNV發(fā)生，繼而導致嚴重的不育。為了證實這個假設(shè)，本研究采用全基因組Affymetrix6.0芯片在1，000例NOA患者和1，703例有生育史的男性對照樣本中進行全基因組拷貝數(shù)變異初篩。采用Affy6CNV分析軟件對芯片數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制以及CNV的鑒定，研究結(jié)果支持了我們的假設(shè)，即精子發(fā)生是受到整個基因組的遺傳變異調(diào)節(jié)的。X染色體尤其富集了很多調(diào)節(jié)精子發(fā)生的基因，X染色體上罕見的大于100Kb的缺失在病例組

10、中的出現(xiàn)頻率是對照組的2倍（OR=2.05，P=0.01）。在整個基因組中，我們發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)單次的拷貝數(shù)變異在病例組中的頻率是對照組的2.4倍(P＜0.02)。并且發(fā)現(xiàn)117個基因，例如SYCE1，包含了47個重組熱點，很大程度上會導致基因組紊亂從而導致不育。隨后采用7900HT Realtime-PCR儀對初篩結(jié)果進行技術(shù)驗證，采用AccuCopy多重基因拷貝數(shù)檢測試劑盒進行擴大樣本驗證，擴大樣本驗證階段的納入了1，500例NOA患者和有

11、生育史的1，600例健康男性對照。其中常染色體MAST2基因僅在3例初篩樣本中發(fā)生拷貝數(shù)重復，在驗證階段病例中發(fā)現(xiàn)11例拷貝數(shù)重復，對照中存在1例拷貝數(shù)重復(P＜5×10-5)。
　　我們的研究結(jié)果證明了不僅僅是Y染色體，整個基因組的突變都會影響精子發(fā)生。其中Y染色體的變異對疾病的影響是最大的，其次是X染色體，最后是常染色體。并且發(fā)現(xiàn)在染色體上的某個區(qū)域表現(xiàn)出罕見CNV在病例組相較于對照組存在富集現(xiàn)象。這些研究結(jié)論豐富了我們對于精

12、子發(fā)生的理解，更可以對以后的診斷和治療提供精確的靶點。
　　第二部分 中國男性非梗阻性無精子癥Y染色體單倍群與全基因組單核苷酸多態(tài)性位點交互作用研究
　　由于GWAS通常是對常染色體上的單個多態(tài)性位點的研究，忽略了大片段的結(jié)構(gòu)變異以及性染色體上的多態(tài)位點，因此，本文的第一部分通過對芯片中的拷貝數(shù)變異情況進行分析，得到了與NOA發(fā)生有關(guān)的拷貝數(shù)變異情況;本文的第二部分開展了常染色體多態(tài)性與NOA的關(guān)聯(lián)研究，并進一步結(jié)合Y染色體

13、單倍群的信息，深入挖掘常染色體多態(tài)性與Y染色體單倍群的交互作用。
　　前期已有男性不育的全基因組關(guān)聯(lián)研究報道，但是由于樣本量較小，且是在歐洲人群中開展的，研究結(jié)果較為局限，因此有必要在中國漢族男性人群中開展一項大樣本的GWAS以尋找新的NOA易感位點。我們在中國人群中開展了多階段的NOA病例對照研究，第一階段采用Affymetrix6.0芯片在1，000例NOA患者和1，703例有生育史的男性對照樣本中進行初篩。
　　隨后通

14、過兩階段擴大樣本驗證對初篩結(jié)果進行驗證，第一階段驗證樣本為1，180例病例和2，082例對照，基因型分析采用的是TaqMan Openarry等位基因分型技術(shù)。第二階段驗證樣本為766例病例和1，995例對照，基因型分析采用TaqMan基因分型平臺。兩階段驗證結(jié)果顯示PRMT6(位于1p13.3區(qū)域的rs12097821)，EX0（位于1p36.32區(qū)域的rs2477686）和SOX5（位于12p12.1區(qū)域的rs10842262）驗證

15、成功，這些位點與NOA發(fā)病風險的增加顯著相關(guān)，提示這些遺傳變異可以作為中國漢族男性NOA潛在的易感標志物。
　　本課題組前期在東亞人群的研究中發(fā)現(xiàn)Y染色體單倍群K*可能承受更高的男性不育的風險。而Y染色體單倍群O3e*表現(xiàn)出的則是保護作用?；赮染色體功能的多樣性，我們推測Y染色體單倍群K*和單倍群O3e*可能是伴隨著基因調(diào)控原件在精子發(fā)生過程中發(fā)生危害或保護作用。作為遺傳背景中一個主要的因素，Y染色體單倍群可能是一些表型的變異，

16、例如SNPs的一個基礎(chǔ)?，F(xiàn)有的關(guān)聯(lián)研究通常僅考慮了Y染色體或僅考慮了常染色體，這會導致不同研究人群甚至相同的研究人群結(jié)果的不一致性。因此，為了排除疾病關(guān)聯(lián)分析中遺傳背景的影響，本研究第二部分對所有樣本進行Y染色體單倍群分型工作，在此基礎(chǔ)上采用大樣本病例-對照研究設(shè)計，將全基因組關(guān)聯(lián)研究的多態(tài)性結(jié)果與人類遺傳背景Y染色體單倍群資料相結(jié)合。
　　Y染色體具有較高的遺傳變異性且在性別決定及精子發(fā)生方面都起到重要作用。因此，為了研究Y染色

17、體單倍群能否影響常染色體變異的效應，我們在1，000個NOA患者和1，703個有生育史的男性對照GWAS研究的基礎(chǔ)上，通過交互作用來研究兩者的關(guān)聯(lián)。通過Logistic回歸模型，我們發(fā)現(xiàn)O3e*單倍型在精子發(fā)生過程中起到保護作用(OR=0.68，95％CI=0.52-0.89;P=5.55×10-3)，隨后，我們探索了O3e*單倍型與常染色體上的多態(tài)性位點之間的潛在交互作用，我們的結(jié)果顯示在NOA患者中O3e*單倍型與rs1113548

18、4位點之間存在協(xié)同交互作用（OR=2.07，P=9.89×10-5）。此外，生物信息學分析顯示那些顯著的SNP位點所在的基因大多富集在免疫相關(guān)通路。這是首個在全基因組水平研究Y染色體單倍群與常染色體多態(tài)性之間交互作用的研究。本研究結(jié)果對于深入闡述人類常染色體多態(tài)性與Y染色體單倍群的交互作用在精子發(fā)生過程中的作用及其可能的遺傳機制有著重要的理論和現(xiàn)實意義，揭示了無精子癥的部分發(fā)病原因，也為男性不育的致病機制提供了新的啟示，最終為不育癥的診