PARD3基因單核苷酸多態(tài)性和拷貝數(shù)變異與神經(jīng)管畸形發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　 在我國，隨著傳染性疾病的發(fā)病與死亡率顯著降低，出生缺陷和遺傳病已成為顯著問題。神經(jīng)管畸形(neuraltubedefects，NTDs)是一種嚴重的出生缺陷疾病，指在胚胎早期發(fā)育過程中神經(jīng)管閉合不全而導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)畸形。目前，全世界NTDs的發(fā)病率約為1-2‰。我國是NTDs高發(fā)地區(qū)，最新統(tǒng)計，NTDs在我國山西省部分地區(qū)發(fā)病率高達19.94‰，因此，NTDs仍然是影響我國人口素質(zhì)、危害生命和生活質(zhì)量的重要公共

2、衛(wèi)生問題。NTDs是多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，目前的研究認為NTDs是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。葉酸等環(huán)境因素在NTDs發(fā)生中的作用已引起廣泛重視。但是，其遺傳機制仍不明確。大量的研究表明，細胞極性的建立過程與NTDs的發(fā)生密切相關(guān)，其中頂-基底極性蛋白復(fù)合體PARD3-PAR6-aPKC具有重要作用，尤其是其核心組分PARD3的作用不容忽視。近期的研究表明PARD3在斑馬魚初級神經(jīng)胚形成中具有關(guān)鍵作用，它的極性分布對于發(fā)育過程中的非對

3、稱性分裂，神經(jīng)細胞軸突的形成和上皮細胞緊密連接的建立是必需的。PARD3缺失導(dǎo)致分裂的神經(jīng)管上皮細胞不能穿過中線，鏡像對稱分布失敗，異常神經(jīng)管形成。另外有研究表明PARD3減少導(dǎo)致出現(xiàn)腦水腫，腦脊髓液流動異常等人類NTDs的伴隨癥狀。隨著對極性蛋白PARD3在斑馬魚等脊椎動物神經(jīng)胚形成過程中的作用研究不斷深入，PARD3在人類神經(jīng)胚形成中的作用引起越來越多研究者的重視。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphi

4、sm，SNP)和拷貝數(shù)變異(copynumbervariation，CNV)是基因組多態(tài)性的兩種重要形式，它們在人類表型多樣性以及人類對疾病的易感性方面具有重要作用。大量的研究顯示人類基因組中的SNP和CNV與一些出生缺陷疾病相關(guān)。而目前PARD3基因SNP和CNV的研究僅局限于腫瘤和炎癥。因此，探討PARD3基因SNP和CNV與NTDs發(fā)生的相關(guān)性有可能為NTDs的發(fā)病機制研究提供新的線索。
　　 目的：
　　 1．探

5、討PARD3基因SNP與中國山西省出生缺陷高發(fā)區(qū)NTDs發(fā)生的相關(guān)性。
　　 2．檢測PARD3基因全部外顯子區(qū)CNV情況，探討PARD3基因外顯子區(qū)CNV在中國山西省出生缺陷高發(fā)區(qū)NTDs發(fā)生中的作用。
　　 方法：
　　 1．采用病例對照研究，收集我國山西省出生缺陷高發(fā)區(qū)NTDs標本224例，對照組為非病理性終止妊娠的正常標本253例。提取脊髓組織DNA，利用MassARRAY分子量陣列分析平臺中的iPLEX

6、GoldSNPGenotyping系統(tǒng)，檢測PARD3基因上53個SNP位點的基因分型，用SPSS軟件和SHEsis軟件分析這53個SNP位點及相應(yīng)單體型與中國山西省出生缺陷高發(fā)區(qū)NTDs發(fā)生的相關(guān)性。
　　 2．采用病例對照研究，收集我國山西省NTDs標本168例，對照組為非病理性終止妊娠的正常標本231例。提取脊髓組織DNA，改進MassARRAY分子量陣列分析平臺中的iPLEXGoldSNPGenotyping系統(tǒng)，分析P

7、ARD3基因上25個外顯子的拷貝數(shù)，用real-timePCR和普通PCR后常規(guī)測序的方法對部分結(jié)果進行驗證。對有缺失的標本進行組織特異性檢測，并初步分析其對PARD3蛋白功能的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1．共挑選了PARD3基因上53個SNP進行檢測，去掉分型成功率低于90％的2個位點，不符合Hardy-Weinberg平衡的2個位點和微效等位基因頻率小于5%的2個位點，共對47個SNP進行了病例一對照關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果

8、顯示，有6個SNP位點(rs2496720,rs2252655,rs3851068,rs118153230,rs10827337andrs12218196)的MAF在病例和對照組有明顯差別(P＜0.05)，這種差別在無腦兒中尤其明顯。我們對以上有關(guān)聯(lián)的位點進行了單體型分析，它們共構(gòu)成了4種常見的單體型，這4種單體型在病例和對照組均有明顯差別（P＜0.001）。根據(jù)表型進行分層分析后顯示，有3種單體型(TGTGGT，TACGAC和TACG

9、GT)在無腦兒組和對照組仍然有明顯差別（P＜0.05）。只有一種單體型(TACGAC)在脊柱裂組和對照組有明顯差別(P＜0.05)，此外，研究還發(fā)現(xiàn)“CGTGGT”這種單體型是無腦兒獨有的，提示其和無腦兒強烈的相關(guān)性。
　　 2．我們對MassARRAY分子量陣列分析平臺中的iPLEXGoldSNPGenotyping系統(tǒng)中檢測CNV的方法進行了改進，結(jié)果表明改進后的方法準確性高，操作簡便，適用范圍更廣。
　　 3．對P

10、ARD3基因25個外顯子的CNV檢測表明，第21和25號外顯子病例和對照組均有拷貝數(shù)增加，兩組無明顯差異。第14號外顯子病例組有一雜合性缺失，在人類基因組拷貝數(shù)數(shù)據(jù)庫(databaseofgenomicvariants，DGV)中未發(fā)現(xiàn)此微缺失的報道。其余外顯子未檢測到拷貝數(shù)變異。對6種組織（脊髓，肝，心，肺，腎，皮膚）的檢測結(jié)果表明，第14號外顯子的雜合性缺失無組織特異性。用PCR后測序的方法，我們明確了這一雜合性缺失的確切位置。用W

11、esternblotting方法，檢測了心和腎組織中蛋白的表達，結(jié)果顯示，這一雜合性缺失顯著降低了100kDa異構(gòu)體蛋白的表達。
　　 結(jié)論：
　　 PARD3基因上6個SNP與中國山西出生缺陷高發(fā)區(qū)NTDs的發(fā)生相關(guān)，這種相關(guān)性受NTDs表型的影響。PARD3基因外顯子區(qū)CNV在中國山西出生缺陷高發(fā)區(qū)人群較少見，本研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了第14號外顯子微缺失及確切位置，這種缺失導(dǎo)致PARD3蛋白功能改變，可能是無腦兒的致病原因