巨噬細(xì)胞ly6Chigh向ly6Clow亞群轉(zhuǎn)變?cè)诟螕p傷修復(fù)中的調(diào)控作用與機(jī)制研究.pdf

1、各種致病因素導(dǎo)致的肝損傷修復(fù)是一個(gè)多細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)過程。體現(xiàn)在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性、凋亡和壞死，和肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞活化。長(zhǎng)期慢性損傷引起肝臟膠原纖維沉積導(dǎo)致肝纖維化-肝硬化形成，而急性大量肝細(xì)胞損傷壞死則導(dǎo)致急性肝衰竭。肝硬化和肝衰竭都是臨床上常見而且嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在肝損傷修復(fù)過程中，發(fā)揮著雙重調(diào)控作用。研究表明，對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞的有效干預(yù)可以影響肝損傷修復(fù)過程。因此，針對(duì)于肝損傷中巨噬細(xì)胞的作

2、用和功能的研究可能為治療各種肝臟疾病提供新靶點(diǎn)。
　　肝臟巨噬細(xì)胞根據(jù)其起源和功能可以分為不同亞群，它們?cè)诟螕p傷修復(fù)中發(fā)揮不同的功能。受到損傷因素刺激后，肝臟定居型巨噬細(xì)胞凋亡壞死，骨髓來源巨噬細(xì)胞向肝臟浸潤(rùn)。后者表現(xiàn)很強(qiáng)的功能異質(zhì)性，在肝損傷的不同階段，可以分為ly6Chigh（ly6Chi）和ly6Clow（ly6Clo）兩個(gè)不同功能狀態(tài)的亞群，ly6Chi巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為促炎促損傷的作用，而ly6Clo巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)為促纖維降

3、解和促修復(fù)作用，因此肝臟中l(wèi)yChi/ly6Clo比例可以作為評(píng)價(jià)肝臟巨噬細(xì)胞整體功能的重要指標(biāo)。研究表明，ly6Clo可能是由ly6Chi細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來的，但調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究。因此，研究肝損傷修復(fù)中巨噬細(xì)胞ly6Chi向ly6Clo亞群轉(zhuǎn)變的作用和分子機(jī)制，對(duì)靶向不同巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行肝病治療具有重要意義。
　　我們之前的研究表明，回輸M1型巨噬細(xì)胞可以顯著地減輕小鼠肝臟纖維化，與肝內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量增加和肝內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)上

4、調(diào)相關(guān)。然而，M1回輸減輕肝纖維化是否與肝內(nèi)巨噬細(xì)胞ly6Chi向ly6Clo亞群轉(zhuǎn)變相關(guān)，其可能的機(jī)制是什么，仍需要進(jìn)一步的研究。
　　Notch信號(hào)在進(jìn)化上高度保守，參與多種細(xì)胞命運(yùn)選擇，在髓系細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)上均發(fā)揮著重要調(diào)控作用。近期大量研究和我們的前期工作均表明，活化的巨噬細(xì)胞表達(dá)Notch信號(hào)途徑的多種分子，并且Notch信號(hào)可以參與巨噬細(xì)胞活化模式的調(diào)控。此外，Notch信號(hào)還可以通過CYLD-NFκB信號(hào)

5、參與巨噬細(xì)胞激活和功能的調(diào)控進(jìn)而影響肝纖維化進(jìn)程。那么Notch信號(hào)是否參與肝臟巨噬細(xì)胞ly6Chi向ly6Clo亞群轉(zhuǎn)變，是否可作為靶向肝臟巨噬細(xì)胞亞群治療肝纖維化的靶點(diǎn)，是亟待解決的問題。
　　因此，針對(duì)上述問題，開展了以下研究：
　　1.建立不同極化類型巨噬細(xì)胞回輸治療四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，利用TUNEL和免疫熒光等方法研究細(xì)胞回輸對(duì)纖維化肝臟星形細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用；
　　2.FACS分析肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞

6、，檢測(cè)不同極化類型巨噬細(xì)胞回輸后對(duì)肝臟免疫細(xì)胞亞群的影響；
　　3.免疫磁珠分選技術(shù)獲得回輸后肝纖維化小鼠肝臟巨噬細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的變化；
　　4.免疫組化和生化檢測(cè)，觀察細(xì)胞回輸后肝臟細(xì)胞增殖和肝功能變化；
　　5.利用CCR2敲除小鼠和氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除實(shí)驗(yàn)，研究M1型細(xì)胞回輸調(diào)控肝臟微環(huán)境不同來源巨噬細(xì)胞的作用。
　　6.在髓系RBP-J敲除小鼠上建立肝纖維化模型，F(xiàn)ACS檢測(cè)肝

7、臟髓系細(xì)胞亞群的變化；
　　7.在野生小鼠上建立肝切后再生模型，利用免疫染色、FACS等研究肝再生過程中巨噬細(xì)胞亞群的變化；
　　8.在髓系RBP-J敲除小鼠上建立肝切后再生模型，利用免疫組化染色、FACS等研究髓系Notch信號(hào)阻斷對(duì)肝再生的影響。
　　結(jié)果：
　　1.回輸M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)肝臟NK細(xì)胞數(shù)目增多和活性增強(qiáng)，促進(jìn)肝臟TRAIL分子的表達(dá)，誘導(dǎo)HSC凋亡，進(jìn)而減少肝臟膠原產(chǎn)生；
　　2.促進(jìn)自

8、體巨噬細(xì)胞向纖維化肝臟募集，并促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞由ly6Chi向ly6Clo亞群轉(zhuǎn)變，使得促纖維消融巨噬細(xì)胞亞群數(shù)量增多，增加肝臟膠原降解；
　　3.通過促進(jìn)纖維化小鼠肝細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝臟損傷修復(fù)，進(jìn)而緩解纖維化；
　　4.回輸?shù)腗1型巨噬細(xì)胞維持其M1表型，但數(shù)量逐漸減少，提示細(xì)胞回輸對(duì)微環(huán)境的改變主要發(fā)生于回輸早期；
　　5.在肝纖維化模型中，發(fā)現(xiàn)髓系細(xì)胞Notch信號(hào)阻斷促進(jìn)巨噬細(xì)胞由ly6Chi向ly6Clo亞群

9、轉(zhuǎn)變，可能是減輕肝臟纖維化的細(xì)胞學(xué)機(jī)制；
　　6.在肝切除再生中，伴隨著巨噬細(xì)胞亞群的變化，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞由ly6Chi向ly6Clo亞群轉(zhuǎn)變可能參與肝再生的調(diào)控。進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因小鼠肝再生模型發(fā)現(xiàn)，髓系細(xì)胞Notch信號(hào)阻斷促進(jìn)巨噬細(xì)胞ly6Chi向ly6Clo亞群轉(zhuǎn)變，可能參與肝再生過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)控。
　　綜上所述，ly6Clo巨噬細(xì)胞在肝損傷再生修復(fù)中發(fā)揮重要作用，髓系細(xì)胞Notch信號(hào)缺失可能促進(jìn)ly6Ch