CD19+CD24hiCD38hiBreg在PBC患者外周血中表達及對Th1細胞分化影響的研究.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis，PBC)是一類進展緩慢的肝臟自身免疫性疾病。臨床常見抗線粒體抗體(Antimitochondrial antibody，AMA)陽性、高水平的堿性磷酸酶等異常實驗室指標;并伴有慢性膽汁淤積、非化膿性肝內(nèi)膽管破壞等主要病理表現(xiàn)。中、晚期PBC患者的內(nèi)科治療沒有滿意的效果，且治療手段比較單一。因此，對PBC的早期診斷治療是非常必要的。目前，尋求新的治療靶點是PBC研究的

2、熱點。
　　B淋巴細胞的異常活化，自身抗體的產(chǎn)生是誘導PBC發(fā)病的主要因素。B細胞不僅具備產(chǎn)生抗體、提呈抗原等作用，而且還可以負向調(diào)節(jié)機體的免疫應答。早在20世紀90年代就有研究者在自身免疫性實驗性腦脊髓炎的小鼠模型實驗中發(fā)現(xiàn)B細胞剔除后的小鼠病情惡化程度增高，并首次在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性B細胞(regulatoryB cells，Bregs)。隨后系列研究進一步證實Bregs的存在，并指出其在免疫調(diào)節(jié)作用的重要性。近年來，已有研究

3、者分別在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic LupusErythematosus，SLE)、天皰瘡、血管炎等不同的自身免疫性疾病中研究CD19+CD24hiCD38hiBreg的生物特性及相關作用。然而，有關CD19+CD24hCD38hiBreg在PBC的研究目前尚未見任何闡述。
　　目的：
　　觀察CD19+CD24hiCD38hiBreg在PBC患者外周血中的表達情況。分析該群細胞與疾病的相關性，并初步探討PBC外周血中

4、CD19+CD24hiCD38hiBreg對輔助性T細胞1(Thelper cell1，Th1)、輔助性T細胞17(T helper cell17，Th17)細胞分化的影響，為PBC免疫機制的研究及未來治療策略的開發(fā)提供新的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.采集PBC患者組與健康對照組(HC)的EDTA抗凝血，密度梯度離心法提取外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)

5、，流式細胞儀檢測CD19+B細胞以及CD19+CD24hiCD38hiBreg在CD19+B細胞的表達頻率。比較上述兩者在PBC患者與正常人中的變化情況。
　　2.采集PBC患者組血清，用Modular PPT生化分析儀檢測患者的ADA、ALT、AST、GGT、ALP、TBIL、DBIL、IBIL、TBA等肝功相關指標，分析其與CD19+CD24hiCD38hiBreg的相關性。
　　3.流式細胞儀檢測HC組中Th1、Th1

6、7細胞的頻率，分別與HC組的CD19+CD24hiCD38hiBreg進行相關性分析，初步分析HC組中Th1、Th17細胞的頻率與CD19+CD24hiCD38hiBreg的潛在關系。
　　4.流式細胞儀檢測PBC組中Th1、Th17細胞的頻率，分別與PBC組的CD19+CD24hiCD38hiBreg進行相關性分析，初步分析PBC組中Th1、Th17細胞的頻率與CD19+CD24hiCD38hiBreg的潛在關系。
　　4

7、..流式分選正常人的CD4+T細胞與CD19+CD24hiCD38hiBreg、PBC的CD19+CD24hiCD38hiBreg。正常人CD4+T細胞單獨培養(yǎng)作為對照;將正常人CD4+T細胞分別與正常人CD19+CD24hiCD38hiBreg、PBC患者的CD19+CD24hiCD38hiBreg共培養(yǎng)。流式檢測Th1細胞的分化情況。
　　結果：
　　1.外周血中CD19+B細胞所占比例情況:PBC組為(12.210±6

8、.204)％， HC組為(8.469±3.399)％;且具有顯著差異(P=0.009)。此外，PBC組中CD19+CD24hiCD38hiBreg/CD19+B細胞的比例(12.379±6.417)％較HC組(4.225±3.318)％的比例增高，且具有統(tǒng)計學意義(p=0.000)。
　　2.PBC中CD19+CD24hiCD38hiBreg與TBIL(P=0.049, r=0.535)、DBIL(P=0.035,r=0.566)

9、、IBIL(P=0.046，r=0.521)、TBA(P=0.014，r=0.619)呈正相關性。
　　3..HC組中Th1、Th17頻率為(11.807±5.144)％、(0.846±0.904)％。其中HC組中CD19+CD24hiCD38hiBreg與Th1細胞具有負相關性（P=0.017，r=-0.426），與Th17細胞沒有相關性(P=0.941，r=0.014)。
　　4.PBC組中Th1、Th17頻率為(17.

10、689±7.444)％、(1.797±2.784)％。其中PBC組中CD19+CD24hiCD38hiBreg與Th1具有正相關性(P=0.003，r=0.677)，與Th17沒有相關性(P=0.171，r=0.348)。
　　5.本實驗將正常人CD4+T細胞單獨培養(yǎng)作為對照;HC中CD19+CD24hiCD38hiBreg、PBC中CD19+CD24hiCD38hiBreg分別與正常人CD4+T細胞共培養(yǎng)，Th1細胞分化的基本情

11、況如下:(17.367±2.747)％、(4.173±1.878)％與(48.567±7.522)％。其中，PBC組中CD19+CD24hiCD38hiBreg與正常人CD4+T細胞共培養(yǎng)后Th1細胞分化的頻率較正常人CD4+T細胞單獨培養(yǎng)、HC組中CD19+CD24hiCD38hiBreg與正常人CD4+T細胞共培養(yǎng)都增高，且具有統(tǒng)計學意義(P=0.001)、(P=0.000)。HC組中CD19+CD24hiCD38hiBreg與正常

12、人CD4+T細胞共培養(yǎng)后Th1細胞的分化頻率較正常人CD4+T細胞單獨培養(yǎng)、PBC組中CD19+CD24hiCD38hiBreg與正常人CD4+T細胞共培養(yǎng)都降低，且具有統(tǒng)計學意義(P=0.043)、(P=0.000)。
　　結論：
　　PBC患者外周血中CD19+CD24hiCD38hiBreg/CD19+B細胞的比例升高。且PBC患者外周血中CD19+CD24hiCD38hiBreg比例與肝內(nèi)損傷呈正相關。同時，我們的實