CD33+HLA-DR-髓源抑制性細胞在腎癌患者外周血中的表達及臨床意義.pdf

1、研究背景:腎細胞癌(RCC)是威脅人類健康的常見腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計近年來以2.5％的年均增長率穩(wěn)步遞增，RCC約占成人全身惡性腫瘤的3％，是泌尿系統(tǒng)最致命的癌癥，最終致死率超過40％，而這一比例在前列腺癌和膀胱癌中僅約20％。約20％～30％的患者將出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，臨床局限性腎癌行腎切除術(shù)后約20％～40％會發(fā)生轉(zhuǎn)移。近年來由于超聲等影像檢查的應(yīng)用，腎癌早期診斷率上升，可能提高腎癌患者的預后。腎癌的發(fā)生率在過去50年中持續(xù)增長，年均死亡率上升至

2、36.5％。過去20年在腎細胞癌患者診斷、分期和治療的顯著進步，提高了患者的生存率，改變了腎細胞癌的自然病程。盡管在轉(zhuǎn)移性腎癌患者生物治療和免疫治療有效率仍然只有15～25％。近來在腎癌發(fā)病機制、腫瘤行為和分子生物學方面的研究為早期診斷腎癌、更好地預測腫瘤預后以及提高腎癌細胞患者的生存率提供了可能。大量的基因、細胞遺傳學、免疫組織化學的分析和/或蛋白質(zhì)組學方法，生物標記，讓臨床醫(yī)生早期發(fā)現(xiàn)腎癌，為患者疾病的結(jié)果提供預后信息，不過至今在腎

3、細胞方面仍未發(fā)現(xiàn)特別有效的治療方法。
　　 腎癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷困難，延誤診斷主要是因為其缺乏典型的臨床表現(xiàn)，和泌尿系統(tǒng)其他腫瘤相比，腎細胞癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性更大，轉(zhuǎn)移性腎癌是臨床治療的一大挑戰(zhàn)，因為其對放射治療和化學治療均不敏感。近年來新的絡(luò)氨酸激酶抑制劑舒尼替尼和索拉非尼已用于臨床，初步取得了令人滿意的效果，實驗證明其抗腫瘤的機制之一是與腫瘤患者體內(nèi)的髓源抑制性細胞(MDSCs)有關(guān)，其能單獨降低或是聯(lián)合其他藥物降低患者體內(nèi)

4、MDSCs的水平，從而改善患者的免疫抑制。
　　 有不少研究報道了一群抑制性的細胞群體—MDSCs，在動物模型、腫瘤患者的外周血、淋巴器官、骨髓和腫瘤部位都發(fā)現(xiàn)了其存在，在小鼠，MDSCs公認的表型為Gr-1+CD11b+，根據(jù)其與Gr-1分子中不同表位(Ly6G、Ly6C)的抗體結(jié)合特異性不同分為兩個亞群:單核細胞樣的MDSCs亞群CD11 b+Ly6G2-Ly6Chigh(Gr-1low)(即Mo-MDSCs)，和粒細胞樣的

5、MDSC亞群CD11 b+Ly6G+Ly6Clow(Gr-1high)(即PMN-MDSCs)。在人類，MDSCs上無公認的表型，通常認為其可分為CD14+單核系MDSCs或CD15+粒系MDSCs，同樣表達共同的髓系標志CD11b和CD33但是缺乏HLADR和其他成熟的淋巴細胞表面標記CD3/CD19/CD56。人類不同類型的腫瘤可能誘導不同的MDSCs亞型，新近報道，在非小細胞肺癌患者中存在表型標記為CD11b+CD14-CD15+

6、HLADR-的粒系MDSCs。單核系CD14+CD11b+HLADR-/low MDSCs被發(fā)現(xiàn)存在在惡性黑色素瘤、肝細胞癌和卵巢癌，提示不同的腫瘤患者中，其MDSCs的表型可能不同。
　　 這群細胞曾經(jīng)被稱為自然抑制細胞、未成熟髓細胞(IMC)、髓系抑制細胞(MSC)，雖然這種命名反應(yīng)了他的生物學功能，但是易和間充質(zhì)干細胞(MSC)混淆，不利于研究，于是2007年該領(lǐng)域的學者建議將其命名為MDSCs。在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程

7、中，MDSCs被認為是一個關(guān)鍵的免疫抑制細胞，其免疫抑制能力已經(jīng)在多種惡性腫瘤中報道，如頭頸部腫瘤、前列腺癌、乳腺癌等。且有證據(jù)表面其在外周血中的水平與疾病的進展程度和腫瘤分期有關(guān)，其通過抑制腫瘤的免疫促進腫瘤的生長。還有研究證明MDSCs能促進血管的生成和腫瘤的轉(zhuǎn)移。此外，除了腫瘤，感染、創(chuàng)傷、自身免疫性疾病等病理狀態(tài)下MDSCs的水平會升高。
　　 在有關(guān)于MDSCs和腫瘤的相關(guān)研究中， Gabitass，R.F等證明外周血

8、MDSCs在胰腺癌（46例）、食道癌（60例）和胃癌（25例）是顯著升高的，且與臨床分期有關(guān)。MDSCs增加的比例和死亡增加的風險相關(guān)，在多變量分析中，MDSCs的水平是一個獨立的預后因素，MDSCs的比例每增加一個單位，死亡風險將增加22％，（HR1.22，95％可信區(qū)間1.06-1.41）。
　　 研究目的:盡管在動物模型中有一些研究MDSCs的表型和功能，但是關(guān)于MDSCs在人類腫瘤中的作用研究還偏少，且主要涉及基礎(chǔ)性研究

9、，與臨床相關(guān)的研究更少，本研究與臨床聯(lián)系較為緊密。根據(jù)以往資料選擇CD33+HLA-DR-作為MDSCs的表型，對比其在腎癌患者和健康志愿者外周血單個核細胞中的水平變化，探討其與腎癌的臨床分期和病理特征的相關(guān)性，以及術(shù)前和術(shù)后一月其在外周血中的變化情況，考慮其作為臨床判斷預后和指導治療的指標可能性，通過檢測其水平將有助于早期診斷和早期治療腎癌患者，協(xié)助減少一些對患者不必要的治療和檢查，為進一步闡明腎癌發(fā)生機制和尋找新的治療靶點提供理論基

10、礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　 材料和方法:標本取自2011年6月至2012年10月在珠江醫(yī)院泌尿外科接受治療的腎癌患者，共44例，入組患者均符合腎癌的CT和病理組織學診斷標準，年齡23-78歲，中位年齡51歲，其中男性患者27例，女性患者17例，50歲以上30例，50歲以下14例。入院前未行其他治療（放療、化療、免疫治療等），因血尿或體檢發(fā)現(xiàn)，無合并其他系統(tǒng)腫瘤，近期沒有外傷和感染性疾病及自身免疫性疾病。按照腎癌臨床的分期標準（2002

11、年AJCC），其中Ⅰ期+Ⅱ期20例、Ⅲ期11例、Ⅳ期13例;根據(jù)術(shù)后患者腎癌標本的病理診斷，腎透明細胞癌(20例)，乳頭狀腺癌（8例），嫌色細胞癌（9例），其他病理診斷如髓樣癌、嗜酸細胞腺瘤等共7例。另外選擇選擇年齡、性別和與腎癌患者組相匹配的健康志愿者18人（健康對照組），年齡25～72歲，中位年齡49歲，既往無腫瘤等相關(guān)疾病，近期無外傷、感染性疾病及自身免疫性疾病。留取兩組人員術(shù)前外周血及術(shù)后一月外周血，術(shù)后腫瘤組織標本及正常腎組織

12、（據(jù)腫瘤邊緣5公分以上）取得后立即置入液氮罐中保存，后轉(zhuǎn)入實驗室-80°冰箱內(nèi)保存，另取一份標本用甲醛固定，石蠟包埋。入組人員均簽署知情同意書，并獲得本單位倫理委員會批準。
　　 采集腎癌患者外周血約2ml，乙二胺四乙酸抗凝。抗凝血2ml以等容積RPMI稀釋，沿試管避緩緩加入4～5ml人血淋巴細胞分離液，2000r/min，離心20min，吸管吸取上層和中層之間單個核細胞層，沖洗2次，均以1500r/min，離心10min，棄上

13、清液，RPMI液稀釋，計數(shù)調(diào)整濃度至106個/ml。取上述細胞液100μl至流式管，加入APC-HLA-DR抗體和FITC-CD33抗體，4℃孵育30min后，PBS沖洗，離心去上清液，加入多聚甲醛固定，24 h內(nèi)上流式細胞儀分析。通過CD33和HLA-DR雙重標記健康志愿者和腎癌患者外周血，利用流式細胞計數(shù)儀分析計數(shù)10000個細胞中表達CD33+HLA-DR-的MDSCs所占的比例，并分析其與臨床病理因素的相關(guān)性。采集健康志愿者外周

14、血約2ml，后續(xù)以同樣方法檢測。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)腎癌患者外周血和健康志愿者外周血中均存在CD33+HLA-DR-MDSCs，但在腎癌患者外周血單個核細胞中所占的比例明顯高于在健康志愿者外周血單個核細胞中的比例[（1.91±0.66）％∶（0.62±0.22）％，P＜0.001]，在腫瘤組織中同樣存在和正常腎組織中存在同樣的變化。
　　 (2)在不同分期的腎癌患者外周血單核細胞中，CD33+HLA-

15、DR-MDSCs的表達有所不同;臨床分期中為晚期的患者CD33+HLA-DR-MDSCs的比例明顯高于早期的患者，Ⅰ+Ⅱ期∶Ⅲ期[（1.46±0.44）％∶（2.04±0.35）％，P＜0.01];Ⅲ期∶Ⅳ期[（2.04±0.35）％∶(2.50±0.64)％，P＜0.05];腎癌外周血CD33+HLA-DR-MDSCs表達與腫瘤進展及腫瘤分期成正相關(guān)(p＜0.05)，外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的水平與淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移呈

16、正相關(guān)，有轉(zhuǎn)移的患者外周血中的水平明顯要高于無轉(zhuǎn)移的患者，[（2.48±0.39）％∶（1.59±0.46）％，(P＜0.001)]，術(shù)后根據(jù)患者腎癌標本的病理診斷，本實驗測得三種病理類型即腎透明細胞癌(CCRCC)、乳頭狀腺癌(PRCC)和嫌色細胞癌(CRCC)的患者外周血單個核細胞中CD33+HLA-DR-MDSCs水平分別為:（2.30±0.13）％、（1.52±0.21)％、（1.76±0.20）％;透明細胞癌患者外周血單個核細

17、胞中CD33+HLA-DR-MDSCs水平高于乳頭狀腺癌及嫌色細胞癌患者(P＜0.01);但是乳頭狀腺癌與嫌色細胞癌患者其水平相差不大(P＞0.05)。
　　 (3)而在腫瘤直徑大于7和小于等于7的患者中則差異不明顯，[(2.08±0.60)％∶（1.70±0.55）％(P＜0.05)]。進一步的研究證明腎癌患者外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的水平與腫瘤的分化程度差異小，無統(tǒng)計學意義[(2.09±0.59)％∶（1.

18、70±0.56）％(P＞0.05)]。在患者性別和年齡（大于等于50歲與小于50歲）方面，外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的水平的差異同樣缺乏統(tǒng)計學意義，男（27例）∶女（17例）[（1.84±0.54）％∶（2.03±0.81）％(P＞0.05)]，在50歲以上(30例)和50歲以下(14例)患者中為[（1.86±0.52）％∶（2.03±0.89）％(P＞0.05)]。
　　 研究結(jié)論:
　　 (1)在腎細