痰瘀同治方藥調節(jié)膽汁酸腸肝循環(huán)的機制研究.pdf

1、研究背景及研究目的：
　　動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為全球性流行的高發(fā)病率、高死亡率的疾病嚴重危害人類健康，近近來在我國其發(fā)病率升高尤為明顯，嚴重危害我國國民的身心健康，并給社會及家庭帶來沉重的經濟負擔[1]。究其原因，高膽固醇血癥是致動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生進展的關鍵危險因素之一。多個隨機對照研究證實:他汀、PCSK9抑制劑、膽酸螯合劑等降低血膽固醇水平的藥物，可顯著降低動脈粥樣硬化相關疾病的發(fā)生率，提示

2、針對膽固醇進行干預是降低相關心血管事件的有效手段。膽汁酸在脂質代謝中起重要作用，其可促進食物中脂肪和脂溶性維生素在腸道的吸收。在腸內約5％的次級膽汁酸隨糞便排出，這是人體最重要的消除膽固醇的方式。中醫(yī)認為高脂血癥等AS致病因素可被稱為“血中之痰濁”。而腸道中過多的脂質、膽汁酸等可稱之為“腑中之痰濁”，在AS的發(fā)生發(fā)展中同樣起著非常重要的作用?；谝陨侠碚摚覀冞x用具有自主知識產權的復方中藥“痰瘀同治”方藥，在經典的高脂血脂聯(lián)合下肢股動脈

3、拉傷誘導小鼠AS模型上，探討復方中藥降脂及抗AS的效果及可能相關機制。
　　研究方法：
　　1、復方中藥干預AS模型小鼠血脂及AS病變的療效研究:1）復方中藥降脂效果及機制的研究:在高脂血癥聯(lián)合股動脈拉傷復合模型動物的基礎上，給予復方中藥或陽性對照藥物阿托伐他汀干預，12周后測定小鼠血漿膽固醇及甘油三酯水平，并行相關組織定量PCR檢測，觀察各組間HMGR、NPC1L1、SR-B1等基因的表達水平差異;2）復方中藥抑制AS進展

4、的相關研究:在上述小鼠模型中，留取相關組織標本行主動脈瓣根部油紅染色，觀察各組小鼠斑塊負荷情況及內中膜厚度比。
　　2、復方中藥對模型小鼠腸道屏障功能的保護及對血中炎癥因子水平的影響:1）復方中藥對腸道屏障功能的保護作用研究:在上述模型小鼠中，選擇不同干預后，經腸道注射熒光染料行腸道滲透性實驗，測定血漿FITC-右旋糖酐水平，觀察各組小鼠腸道滲透熒光染料的差異。行腸道Ki-67染色，并對腸道屏障中黏蛋白、緊密連接等相關基因的表達水

5、平進行定量分析;2）復方中藥對炎癥因子水平的影響的研究:使用流式細胞學方法對上述模型小鼠小鼠血漿中IL-1β、IL-17A、IFN-γ、IFN-β、GM-CSG等水平進行定量分析。
　　3、復方中藥對膽汁酸腸肝循環(huán)及膽汁酸譜的影響:1）復方中藥對膽汁酸腸肝循環(huán)作用機制的研究:在上述模型小鼠中，選擇不同干預后，對膽汁酸肝臟合成及肝臟轉運相關基因的表達水平進行定量分析;2）復方中藥對膽汁酸譜作用的研究:使用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜對上

6、述模型小鼠血漿及糞便中膽酸、脫氧膽酸等進行定量分析。
　　研究結果：
　　1.復方中藥降低AS小鼠血膽固醇及抑制AS病變的作用:實驗表明連續(xù)給藥干預12周后，與對照組相比，復方中藥可顯著降低AS小鼠血漿膽固醇、主動脈斑塊負荷水平及內中膜厚度比值(p＜0.05)。復方中藥可顯著升高腸道NPC1LI1及SR-B1的表達(p＜0.05)，而對血漿甘油三酯水平以及肝臟HMGR、ABCG5/8的表達無顯著作用(p＞0.05)，這點不同

7、于傳統(tǒng)他汀類藥物。
　　2.復方中藥保護腸道屏障功能的作用研究:給藥12周后，復方中藥可顯著降低模型小鼠的腸道滲透性(p＜0.05)，其機制可能與顯著提高腸道m(xù)uc1、Cldn1、Ocln、IL22Rα1基因表達水平(p＜0.05)，同時顯著減低腸道IL-10Rβ的表達(p＜0.05)密切相關。對于腸道屏障功能相關的其他基因，諸如muc3、Cldn2、Tjp等復方中藥并未表現(xiàn)出調節(jié)作用(p＞0.05)，提示復方中藥的腸道屏障功能的

8、保護具有一定的選擇性。復方中藥可顯著降低促炎因子IL-6、IL-12、IFN-γ、 MCP-1的水平(p＜0.05)，同時可顯著升高抗炎因子IFN-β的水平(p＜0.05)。
　　3.復方中藥調節(jié)膽汁酸腸肝循環(huán)進而降脂抗動脈硬化的作用機制研究:連續(xù)給藥干預12周后，與對照組相比，復方中藥可顯著增加血漿TCA、TCDCA水平及糞便DCA、TDCA、TLCA的水平(p＜0.05)，同時顯著減少糞便中CDCA、TCDCA水平及血中DCA

9、的水平(p＜0.05)，與之對應的是復方中藥顯著增加肝臟BSEP、Oatp2基因表達及腸道Ostα/β、FXR的基因表達(p＜0.05)，同時顯著降低腸道ASBT、IBABP、FXR、fgf15基因表達及肝臟fgfr4基因的表達(p＜0.05)，表明復方中藥可改變膽汁酸的腸肝循環(huán)通路，這可能是其調節(jié)血脂進而抗AS的作用機制。同時對肝臟Cyp7a1、Cyp8b1、Ntcp、Oatp1、SHP等基因表達無顯著作用(p＞0.05)，提示與傳統(tǒng)

10、的他汀類藥物的作用機制有顯著差異。
　　研究結論：
　　本研究通過對本實驗室前期系列研究成果的分析，提出復方中藥可能通過調節(jié)膽汁酸腸肝循環(huán)及改善腸道滲透性等多個方面來發(fā)揮其調脂抗AS的假說，研究發(fā)現(xiàn):1)復方中藥干預模型小鼠12周后，可顯著降低AS小鼠血漿膽固醇水平及斑塊負荷，與他汀類藥物作用靶點不同，其并不影響肝臟膽固醇合成的限速酶HMGR的表達水平;2）進行腸道滲透性實驗及相關靶點研究發(fā)現(xiàn):復方中藥可顯著降低模型小鼠的腸

11、道滲透性，該作用主要通過上調muc1、cldn1、ocln等基因的表達來實現(xiàn)，且與和作用于腸道的IL-22相關受體降低密切相關;同時其可促進抗炎因子IFN-β的分泌，抑制促炎因子IL-6、IL-12、IFN-γ、MCP-1的釋放3）進一步研究揭示:復方中藥對膽汁酸腸肝循環(huán)中介導膽汁酸合成相關基因的表達無顯著影響，主要是通過作用于腸肝循環(huán)相關的基因進而發(fā)揮調節(jié)作用，這其中包括提高BSEP、Ostα的基因表達水平，抑制ASBT、IBABP基