IL-1β單克隆抗體在癲癇治療中的價值.pdf

1、研究目的：
　　癲癇是神經(jīng)科常見慢性疾病之一，其病理生理機(jī)制復(fù)雜。近年來癲癇與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)及炎性介質(zhì)的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。
　　最新研究顯示，包括IL-1β在內(nèi)的多種炎性介質(zhì)在癲癇患者及癲癇動物模型的腦組織中表達(dá)水平升高。深入研究發(fā)現(xiàn)IL-1β能提高神經(jīng)元興奮性、增加癇性發(fā)作可能性。本研究通過腹腔注射氯化鋰、匹羅卡品建立癲癇模型，探索能否通過腹腔IL-1β單克隆抗體中和癲癇持續(xù)狀態(tài)所導(dǎo)致IL-1β含量異常升

2、高，觀察白介素1β（IL-1β）單克隆抗體對癲癇持續(xù)狀態(tài)誘導(dǎo)大鼠海馬組織炎癥反應(yīng)的影響。
　　研究方法：
　　72只健康成年雄性 SD大鼠隨機(jī)分為對照組（n=20）、癲癇模型組（模型組，n=26）、IL-1β單抗抗體治療組（治療組，n=26）。模型組和治療組均采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇模型，對照組以相同液體量的生理鹽水替代氯化鋰、匹羅卡品。當(dāng)模型組、治療組大鼠癇性發(fā)作達(dá)到Racine分級的IV-V級發(fā)作且持續(xù)1小時后，腹腔

3、注射溴化甲基阿托品和地西泮解除癇性發(fā)作。治療組大鼠于癲癇發(fā)作30分鐘、7天及14天后分別給予IL-1β單克隆抗體1ml(20ug? ml)腹腔注射，模型組和對照組則給予等量的生理鹽水。模型組和治療組分別于造模后72h、21d兩個時間點(diǎn)隨機(jī)取3只提取海馬組織總蛋白，采用蛋白質(zhì)印記法檢測用藥后72h、21d海馬組織中 IL-1β單克隆抗體的含量。各組大鼠于造模后72h隨機(jī)取10只大鼠斷頭取腦、分離海馬組織和進(jìn)行腹主動脈抽血，用RT-PCR檢

4、測癇性發(fā)作72h后海馬組織中IL-1β、NF-κB mRNA表達(dá)水平，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清中S100B含量。各組于造模后21天，大鼠行心臟灌注固定，分離腦組織進(jìn)行冰凍切片，行免疫熒光法檢測海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞活化情況及行尼氏染色檢測神經(jīng)元凋亡情況。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較IL-1β單克隆抗體對癲癇的干預(yù)是否有效。
　　研究結(jié)果：
　　1.在注射匹羅卡品10~40min后，模型組大鼠開始出現(xiàn)排便排尿、口角流涎、雙眼充血等

5、外周膽堿能反應(yīng)；繼之出現(xiàn)面部抽動、行動刻板、平衡力下降、行走不穩(wěn)等表現(xiàn)；最后出現(xiàn)癲癇發(fā)作的典型癥狀：陣發(fā)性出現(xiàn)咀嚼或牙關(guān)緊閉、頸項(xiàng)強(qiáng)直或全身肌肉僵硬、濕狗樣抖動、四肢不自主抽搐或痙攣，最終出現(xiàn)全身強(qiáng)直-痙攣發(fā)作并失去平衡、跌倒。模型組造模成功率85.29％，死亡率10.34%（68只大鼠，58只成功建立癲癇模型，其中4只在注射匹羅卡品后24h內(nèi)死亡，2只在癲癇發(fā)作后48h內(nèi)死亡，10只未出現(xiàn)典型的癲癇發(fā)作）。
　　2.模型組大鼠海

6、馬組織中僅檢測到少量 IL-1β抗體，考慮與抗體的交叉反應(yīng)有關(guān)，治療組中給藥72h（3.797±0.021）、21d（3.584±0.024）后大鼠海馬組織中IL-1β單克隆抗體的濃度明顯高于模型組（1.278±0.019、1.351±0.010）。與標(biāo)準(zhǔn)濃度比較發(fā)現(xiàn)不同時間點(diǎn)治療組中 IL-1β單克隆抗體的濃度均>3.00ug Ab/g。結(jié)果提示：IL-1β單克隆抗體能夠通過血腦屏障并能保持有效治療濃度（>3.00ug Ab/g）。<

7、br>　　3.模型組IL-1β、NF-κB表達(dá)水平均高于對照組（均P<0.01），治療組IL-1β、NF-κB表達(dá)水平均低于模型組（均P<0.01）。
　　4.對照組血清中S100B蛋白水平較低，與模型組比較，治療組血清中S100B蛋白水平明顯下降（P<0.01）。
　　5.尼氏染色顯示對照組CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細(xì)胞、神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)完整；模型組CA1區(qū)、CA3區(qū)有神經(jīng)元脫失及變形、膠質(zhì)細(xì)胞增生（與對照組比較，P<0.

8、05）；與模型組比較，治療組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細(xì)胞、神經(jīng)元缺失情況顯著減輕（P<0.01）。
　　6.為進(jìn)一步探討 IL-1β單克隆抗體對于膠質(zhì)細(xì)胞增生的影響，觀察造模后第21天海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞增生情況，利用膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、Iba1抗體進(jìn)行熒光雙標(biāo)。免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，正常對照組大鼠海馬無膠質(zhì)細(xì)胞異常增生，SE21天在海馬CA3區(qū)表現(xiàn)為GFAP與Iba1陽性細(xì)胞明顯增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生現(xiàn)象顯

9、著（p<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而治療組GFAP與Iba1陽性細(xì)胞較模型組明顯減少（p<0.01）。膠質(zhì)細(xì)胞活化情況顯著減輕（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　（1）利用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇模型可誘導(dǎo)大鼠表現(xiàn)為典型的癲癇持續(xù)狀態(tài)，模型大鼠進(jìn)入慢性期后，通過尼氏染色及免疫熒光染色觀察到海馬CA1、CA3區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元損傷、膠質(zhì)細(xì)胞增生等病理改變，這些病理改變符合人難治性癲癇的典型病理改變，同時氯化鋰-匹羅卡品模型的發(fā)作

10、分期符合人類癲癇的發(fā)病特點(diǎn)。另外該模型實(shí)驗(yàn)周期短、實(shí)驗(yàn)條件成熟、易操作。以上證據(jù)均提示氯化鋰-匹羅卡品癲癇動物模型可以作為研究癲癇發(fā)病機(jī)制、治療方法等研究方向的重要選擇之一。
　?。?）IL-1β是最強(qiáng)大的促炎因子之一，其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是組織炎癥反應(yīng)的開始。IL-1β作為上游炎性因子能介導(dǎo)多種炎性因子表達(dá)上調(diào)，繼而誘發(fā)下游的炎癥瀑布反應(yīng)，NF-κB為細(xì)胞內(nèi)重要的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)之一，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，活化的NF-

11、κB可促進(jìn) IL-1β基因轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)中通過RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)動物海馬組織中IL-1β、NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組IL-1β、NF-κB mRNA表達(dá)水平較正常組明顯上調(diào)（p<0.05），提示癲癇誘導(dǎo)IL-1β、NF-kB mRNA轉(zhuǎn)錄、免疫炎性因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在SE中發(fā)揮重要作用。
　?。?）S100B是血腦屏障滲漏和星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在癲癇模型大鼠急性期血清中 S100B水平明顯高