T-Synthase對卵巢上皮性癌中相關TCAC表達的影響及相關功能研究.pdf

1、背景:卵巢癌是女性生殖器官常見腫瘤之一，病死率幾乎占婦科腫瘤之首，對婦女的生命造成嚴重威脅。由于卵巢癌具有起病隱匿、易轉移、預后差等特點，大約3/4的患者就診時已屬晚期。手術治療聯(lián)合化療能一定的延長患者生存期，但卵巢癌的死亡率和復發(fā)率仍然較高，五年生存率仍然較低，因此，臨床上迫切需要新的能用于卵巢癌早期診斷和治療的分子標志物，尋找新的卵巢癌相關分子是目前研究的熱點和重點。
　　目前，臨床上診斷癌癥主要依賴于影像，生物標志物，臨床分

2、期以及其他的一些病理學分析，細胞的生物學功能發(fā)生改變被認為是癌癥發(fā)生的標志?，F(xiàn)在人們普遍認識到蛋白質和脂類的糖基化發(fā)生改變也可以作為腫瘤發(fā)生的標志，如CA-125，Tn和Sialyl Tn，它們都是糖基化蛋白，經(jīng)常作為生物學標志物來診斷癌癥。其中，Tn抗原是一種腫瘤相關碳水化合物抗原，通常不在外圍的組織和血細胞中表達，但是卻在人類各種類型的癌細胞中表達，Tn抗原主要來源于一個正常的O-糖基化通路，即聚糖從共同的前體GalNAcα1-O-

3、絲氨酸/蘇氨酸擴展受到阻塞。該前體是在高爾基體中由一個家族多肽的產(chǎn)生的α-N-乙酰氨基半乳糖（ppGalNAcTs）糖蛋白，然后延伸到由單個酶稱為T合酶（核心1β3半乳糖或C1GalT）組成的共同的核心O聚糖Galβ1-3GalNAcα1-OSer/蘇氨酸（T抗原）。形成的T-合酶活性形式需要獨特的分子伴侶稱為Cosmc，該Cosmc（Xq24在人類，XC3小鼠）在X染色體上編碼。Cosmc駐留在內質網(wǎng)（ER），并防止錯誤折疊，聚集新合

4、成的T-合酶，防止蛋白酶體的降解?；钚缘腡-合酶或Cosmc的表達缺失可導致Tn抗原的表達，以及影響它的唾液酸化的唾液酸Tn抗原在大多數(shù)腫瘤中表達。
　　目前關于腫瘤相關性碳水化合物抗原在卵巢癌中的研究尚不多見，T-Synthase, T, Tn和S-Tn在卵巢癌以及正常卵巢組織中的表達情況如何，它們定位于何處，以及它們與分子伴侶Cosmc基因有何密切的關系，它們在腫瘤的形成過程中起著什么關鍵性的作用，這都有待我們通過實驗來進行研

5、究。
　　目的:
　　1.明確T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原在卵巢上皮性癌組織及正常卵巢組織中的表達及分布；
　　2.明確T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原在卵巢癌細胞系中的表達；
　　3.明確不同表達狀態(tài)下的Cosmc在卵巢癌細胞中的生物學功能。
　　方法:
　　1.收集卵巢上皮性癌組織切片和卵巢上皮性癌新鮮組織，通過免疫組織化學和Western Blot的方法檢測卵巢上皮性

6、癌組織和正常卵巢組織中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的分布和表達；
　　2.通過培養(yǎng)兩種卵巢癌細胞系，制作細胞爬片，運用免疫細胞化學的方法檢測卵巢癌細胞中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的分布和表達，同時，運用Western Blot的方法檢測卵巢癌細胞系中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的表達情況；
　　3.構建Cosmc過表達慢病毒載體，轉染卵巢癌細胞后，通過Western Blot

7、的方法檢測細胞系中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原分子表達的變化，闡明T-Synthase唯一分子伴侶Cosmc表達的高低對TCAC表達的影響，然后，通過MTT法和流式細胞儀檢測Cosmc表達對卵巢癌細胞生長和凋亡的影響，運用Transwell實驗檢測Cosmc表達對卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的影響。
　　結果:
　　1.正常卵巢組織和卵巢上皮性癌組織中T-Synthase、T、Tn、S-Tn抗原的表達。
　

8、　運用免疫組織化學實驗對60例癌組織和20例正常組織進行T-Synthase、T、Tn、S-Tn抗原表達的檢測，實驗結果發(fā)現(xiàn)，T-Synthase主要定位于細胞質，其在卵巢上皮性癌組織中的表達較正常組織明顯下調；T抗原主要定位于腺腔表面和外周細胞表面，其在卵巢上皮性癌組織中的表達較正常組織明顯下降；Tn抗原主要存在于胞漿內，其在卵巢上皮性癌組織中的表達較正常組織明顯增高；S-Tn抗原主要定位于胞漿內，在卵巢上皮性癌組織中，S-Tn抗原的

9、表達較正常組織明顯上升。
　　Western Blotting實驗對20例新鮮正常卵巢組織與48例卵巢上皮性癌組織樣本進行T-Synthase、T、Tn、S-Tn抗原表達的檢測，實驗結果表明，在卵巢上皮性癌組織中T-Synthase和T抗原的表達較正常組織明顯下調，而Tn、S-Tn的表達在卵巢上皮性癌組織中較正常組織上升明顯，此結果與免疫組化結果一致。
　　2.卵巢癌細胞系Skov3和A2780中T-Synthase、T、T

10、n和S-Tn抗原的表達。
　　免疫細胞化學實驗對卵巢癌細胞系Skov3和A2780細胞爬片中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的表達進行檢測，結果表明，T-Synthase、T抗原在Skov3和A2780細胞中呈現(xiàn)低表達或不表達，而Tn和S-Tn抗原在Skov3和A2780細胞中出現(xiàn)中度表達或高表達，且S-Tn比Tn的陽性率和敏感性更高。
　　Western Blotting檢測卵巢癌細胞Skov3、A2780中C

11、osmc、T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的表達。實驗結果表明，Cosmc、T-Synthase、T抗原表達在卵巢癌細胞中均不高，而Tn和S-Tn抗原在 Skov3、A2780細胞呈高表達，此實驗結果與免疫細胞化學實驗的結果一致，表明T-Synthase活性的降低抑制了T抗原的表達。
　　3.Cosmc過表達對相關分子表達的影響以及其在卵巢癌細胞中的生物學功能。
　　卵巢癌細胞A2780和Skov3培養(yǎng)后，轉染C

12、osmc慢病毒，熒光顯微鏡下測轉染效率，熒光強度高，轉染效果在80％以上。同時，采用Western Blot檢測Cosmc的表達，轉染Cosmc慢病毒的細胞組較轉染空白對照的細胞，Cosmc的表達量明顯增加，且提高量大于2倍。通過Western Blot檢測Cosmc過表達后，T-Synthase、T、Tn、S-Tn抗原的表達的變化，其結果表明，過表達Cosmc后，其分子伴侶T-Synthase的表達顯著上升，且T抗原的表達也相應增加，

13、而相應的Tn和S-Tn抗原的表達則受到抑制，表明Cosmc可通過上調T-Synthase從而促進T抗原的形成，并抑制Tn和S-Tn抗原的表達。
　　通過流式細胞儀檢測轉染Cosmc慢病毒的Skov3和A2780細胞的凋亡數(shù)。實驗結果表明，Cosmc過表達的卵巢癌細胞Skov3+和A2780+的凋亡數(shù)較對照組細胞Skov3和A2780明顯增加，通過MTT法檢測Cosmc對卵巢癌細胞生長能力的影響，結果表明，過表達Cosmc的細胞其生

14、長能力明顯下降，此結果表明Cosmc過表達可促進卵巢癌細胞的凋亡并抑制其生長。
　　通過分別對轉染Cosmc慢病毒的Skov3+和A2780+細胞進行Transwell實驗，以檢測Cosmc對卵巢癌細胞侵襲能力的影響，實驗結果表明，轉染Cosmc的細胞穿過小室膜的數(shù)量比對照組明顯減少，Cosmc過表達可抑制卵巢癌細胞的侵襲能力。
　　結論:
　　1. T-Synthase、T抗原在卵巢上皮性癌組織中的表達較正常卵巢組織