利用FGF13心肌條件性基因敲除小鼠研究FGF13在心律失常中的作用及其機(jī)制.pdf

1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子同源性因子(Fibroblast growth factorhomologous factors，F(xiàn)HFs)，包括FGF11-FGF14，是一類新發(fā)現(xiàn)的電壓依賴性鈉通道(voltage gated sodium channel，Nav通道)結(jié)合蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)Nav通道的表達(dá)和功能來(lái)調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞的興奮性。Nav通道在可興奮細(xì)胞的興奮性、傳導(dǎo)性上具有重要作用，在心臟，Nav通道異常與多種心律失常的發(fā)生密切相關(guān)。如前期的

2、研究發(fā)現(xiàn)FGF14突變或FGF12/FGF14基因敲除小鼠可引起家族遺傳性脊髓小腦運(yùn)動(dòng)失調(diào)癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，我們最近的研究發(fā)現(xiàn)FGF13在鼠類心肌組織中也有明顯的表達(dá)，且可調(diào)節(jié)心肌Nav通道的功能以及興奮性的傳導(dǎo)，但目前并無(wú)證據(jù)證明FHFs與心律失常的發(fā)生直接相關(guān)，與哪類心律失常相關(guān)。為回答此科學(xué)問(wèn)題，本課題通過(guò)制備FGF13心肌條件性基因敲除小鼠動(dòng)物模型，直接在整體動(dòng)物水平檢測(cè)敲除FGF13對(duì)心肌電活動(dòng)的影響以及是否發(fā)生心律失常，并通

3、過(guò)觀測(cè)敲除FGF13對(duì)心肌動(dòng)作電位特征以及鈉電流的影響來(lái)發(fā)現(xiàn)其可能的細(xì)胞電生理學(xué)機(jī)制，此研究將為揭示FHFs在心律失常中的作用及其機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)資料。
　　第一部分獲得FGF13心肌條件性基因敲除小鼠
　　目的:(1)獲得FGF13心肌條件性基因敲除小鼠。(2)評(píng)價(jià)此基因敲除小鼠在心肌組織中FGF13基因的敲除效果。
　　方法:(1)應(yīng)用電轉(zhuǎn)法，southern雜交，顯微注射，移植等技術(shù)獲得F1代雜合子小鼠(FGF

4、13-flox-neomycin)。(2)利用Flp-deleter小鼠與FGF13-flox-neomycin小鼠交配獲得去除neomycin篩選標(biāo)記基因的FGF13-flox小鼠。(3)利用myh6-Cre小鼠與FGF13-flox小鼠交配以獲得心肌表達(dá)Cre重組酶的FGF13-flox小鼠。(4)給予他莫昔芬可獲得時(shí)空調(diào)控的在心肌特異性敲除FGF13的小鼠。(5)利用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)技術(shù)，蛋白免疫印跡技術(shù)和細(xì)胞免疫熒光染

5、色技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)FGF13心肌組織特異性敲除小鼠的敲除效果。
　　結(jié)果:(1)利用Cre-LoxP基因打靶原理，首先制備了FGF13-flox-neomycin F1代雜合子小鼠，然后將其與Flp-deleter小鼠交配以去除neomycin標(biāo)記篩選基因，最后再將得到的FGF13-flox小鼠與心肌特異性表達(dá)Cre重組酶的myh6-Cre小鼠交配獲得在心肌特異性表達(dá)Cre重組酶的FGF13-flox小鼠，此時(shí)給予他莫昔芬后即獲得時(shí)空調(diào)

6、控的心肌組織特異性敲除FGF13的小鼠(myh6-FGF13)。(2)通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)myh6-FGF13小鼠的心室肌組織中FGF13 mRNA的水平明顯降低，約為野生型的5％。(3)利用蛋白免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照鼠比，F(xiàn)GF13蛋白在myh6-FGF13小鼠心室肌組織的表達(dá)明顯降低。(4)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照鼠比，F(xiàn)GF13蛋白在myh6-FGF13小鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論:我們成功制備FGF

7、13-LoxP小鼠，并經(jīng)與心臟表達(dá)Cre的小鼠雜交，獲得心肌條件性敲除FGF13的基因敲除小鼠，并證明FGF13基因/蛋白在小鼠心室肌中被成功敲除，提示此基因敲除小鼠可用于后續(xù)的相關(guān)研究。
　　第二部分利用FGF13心肌條件性基因敲除小鼠研究FGF13在心律失常中的作用及其機(jī)制
　　目的:(1)觀察FGF13是否與某種心律失常的發(fā)生有關(guān)。(2)探索FGF13引起心律失常發(fā)生的機(jī)制。
　　方法:(1)利用整體動(dòng)物體表心電

8、圖技術(shù)肢體二導(dǎo)聯(lián)的方式，記錄各組小鼠的心電圖，觀測(cè)敲除心肌FGF13是否有心律失常發(fā)生。(2)應(yīng)用電流鉗技術(shù)記錄小鼠心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位，觀察心肌敲除FGF13后動(dòng)作電位的變化。(3)利用電壓鉗技術(shù)檢測(cè)鈉通道電流密度及門控特征的變化。
　　結(jié)果:(1)FGF13心肌條件性敲除小鼠心電圖QRS間期顯著延長(zhǎng)，給予氟卡尼后可誘導(dǎo)出Brugada綜合征特有的心電圖表型。(2)FGF13心肌條件性敲除小鼠心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位幅度明顯降低，0期