hAMSCs對(duì)小鼠創(chuàng)面HA及膠原表達(dá)的影響研究.pdf

1、目的：初步探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells， hAMSCs）小鼠創(chuàng)面局部移植對(duì)ECM中HA及膠原表達(dá)的影響，完善hAMSCs促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制研究，為進(jìn)一步將hAMSCs轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。
　　方法：提取 hAMSCs，取其生長(zhǎng)良好的第3-5代細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面分子標(biāo)記及成脂和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定hAMSCs。以96只C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)

2、動(dòng)物，分為正常組（正常小鼠）、對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基）及實(shí)驗(yàn)組（hAMSCs移植）三組，每組32只動(dòng)物，對(duì)照組小鼠背部脊柱兩側(cè)建立全層皮膚缺損模型（每只2處，共64處），采用DMEM培養(yǎng)基100uL于64處創(chuàng)面周?chē)は颅h(huán)形注射，實(shí)驗(yàn)組小鼠背部脊柱兩側(cè)建立全層皮膚缺損模型后同法創(chuàng)面周?chē)は颅h(huán)形注射hAMSCs（1×106個(gè)/mL）100uL,正常組小鼠不制作皮膚創(chuàng)面作為正常對(duì)照。在建模后1天、3天、7天、14天分別切取各組創(chuàng)面模型皮膚標(biāo)本

3、。記錄對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合過(guò)程的大體外觀，并通過(guò)細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)觀察hAMSCs移植后存活狀態(tài)， Masson染色觀察膠原積累情況，免疫組織化學(xué)染色后觀察創(chuàng)面皮膚組織高分子量HA陽(yáng)性表達(dá)情況，qPCR技術(shù)測(cè)定創(chuàng)面皮膚組織中高分子量HA、I、III的基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈“S”形，F(xiàn)CM結(jié)果顯示：第4代hAMSCs均高表達(dá)CD90、CD105、CD73，其陽(yáng)性率分別96.6％、95.1%

4、、98.1%，低表達(dá)或不表達(dá)CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR，其陰性率為0.3%，細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21d時(shí)行油紅O染色，可見(jiàn)脂滴處呈紅色；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d行茜素紅S染色，可見(jiàn)紅色鈣化結(jié)節(jié)。實(shí)驗(yàn)組小鼠背部創(chuàng)面3、7、14d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)愈合率分別是33.93±2.71、75.17±3.69、98.1±1.66明顯優(yōu)于對(duì)照組27.29±3.41、62.37±5.24、95.46±2.56（P＜0.05），并且瘢痕愈合較其

5、他組都小而柔軟；通過(guò)細(xì)胞示蹤證明局部移植的hAMSCs在建模14d后依舊存活。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組高分子量HA表達(dá)量，高分子量HA分別在1、3、7、14d表達(dá)為40.321±2.348、49.463±1.976、45.463±2.498、40.463±2.341，其表達(dá)量呈先遞增后降低趨勢(shì)，至3d達(dá)到最大表達(dá)量，隨之呈降低變化，對(duì)照組中高分子量HA分別在1、3、7、14d表達(dá)為37.463±2.243、43.463±2.082、3

6、6.463±1.932、30.463±2.987，其表達(dá)量與實(shí)驗(yàn)組變化規(guī)律相同，正常組的高分子量HA表達(dá)量均在27.463±2.671范圍內(nèi)，每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)均小于實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，而且實(shí)驗(yàn)組每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)均大于對(duì)照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。qPCR結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組高分子量HAmRNA表達(dá)在1、3、7、14d分別為0.587±0.046、0.854±0.176、0.679±0.033、0.524±0.066，對(duì)照組0.277±0.

7、033、0.376±0.034、0.261±0.046、0.234±0.024，正常組為0.176±0.076，實(shí)驗(yàn)組III型膠原mRNA表達(dá)在1、3、7、14d分別為0.215±0.014、0.218±0.026、0.225±0.006、0.216±0.048，對(duì)照組0.173±0.009、0.201±0.0035、0.198±0.013、0.199±0.014，正常組為0.151±0.012，實(shí)驗(yàn)組I型膠原mRNA表達(dá)在1、3、7、

8、14d分別為0.251±0.028、0.316±0.045、0.322±0.011、0.298±0.021，對(duì)照組0.505±0.007、0.547±0.079、0.682±0.195、0.719±0.133，正常組為0.146±0.003，其表達(dá)規(guī)律及形式均與免疫組化結(jié)果相對(duì)應(yīng)（P＜0.05），并且I/III型膠原比值在1、3、7、14d實(shí)驗(yàn)組為1.171±0.046、1.469±0.176、1.434±0.033、1.430±0.0

9、66，對(duì)照組為2.926±0.333、2.800±0.034、3.481±0.046、3.602±0.024，正常組為0.971±0.076，對(duì)照組的比值大于實(shí)驗(yàn)組和正常組，實(shí)驗(yàn)組大于正常組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， Masson染色切片膠原染呈藍(lán)色，正常組為正常皮膚組織，膠原排列呈網(wǎng)狀，膠原間間隙較大；1d、3d實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組膠原排列緊密，膠原相對(duì)變粗，膠原間隙相對(duì)變小，染色較深；對(duì)照組膠原纖細(xì)，排列紊亂，膠原間隙增大，染