幾種不同NLS對(duì)重組酶刪除效率影響的初步研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因植物給人類帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的同時(shí)也存在生物安全隱患，因此，近年來(lái)人們一直探索如何消除轉(zhuǎn)基因植物可能帶來(lái)的生物安全性問(wèn)題。已經(jīng)證實(shí)，來(lái)源于微生物的位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)能有效刪除轉(zhuǎn)基因植物中的抗性選擇抗性標(biāo)記基因，現(xiàn)己廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物生物安全控制中。前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室以重組酶系統(tǒng)Cre/loxP與FLP/FRT為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一個(gè)新的基因刪除系統(tǒng)“Gene—deletor”。為了進(jìn)一步提高該系統(tǒng)的刪除效率，本論文在已有研究基礎(chǔ)上，

2、重點(diǎn)研究了核定位信號(hào)序列(nuclear localization signal，NLS)對(duì)重組酶Cre刪除效率的影響。為此合成了四種被證實(shí)在多數(shù)植物中起作用的核定位信號(hào)，將它們分別與GFP：：GUS基因融合構(gòu)建表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化手段將其轉(zhuǎn)入煙草，篩選出入核效率最高的NLS；再將其與重組酶基因Cre融合構(gòu)建表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化煙草，初步分析了NLS融合于Cre的N端對(duì)其入核及刪除效率的影響。主要結(jié)果如下： 1．不同類型NLS協(xié)

3、助蛋白入核效率比較分析 為了提高重組酶入核的效率，本論文選擇四種典型的NLS，分別為：?jiǎn)蜗虻膩?lái)自SV40大T抗原的SV40NLS；雙向的來(lái)自玉米轉(zhuǎn)錄因子Opaque-2的O2NLS；來(lái)自酵母蛋白Mat a-2的rpl25NLS(這個(gè)NLS只被importinβ識(shí)別)，以及類似Mat a-2NLS的來(lái)自玉米轉(zhuǎn)錄因子的NLSC。將它們分別與標(biāo)記基因(GFP：：GUS)融合，構(gòu)建融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草，確定獲得雙功能活性的GFP：G

4、US融合基因后；比較NLSs介導(dǎo)GFP：：GUS融合蛋白入核的效率。 首先，對(duì)葉片上皮細(xì)胞GFP熒光的定性觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因pBI—SV40NLS—GFP：：GUS細(xì)胞層的熒光明顯集中于細(xì)胞核；其他融合了核定位信號(hào)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞與未融合NLS的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中，熒光信號(hào)多呈現(xiàn)彌散分布，沒(méi)有聚集的相對(duì)較強(qiáng)的熒光信號(hào)；非轉(zhuǎn)基因植株中未檢測(cè)到任何熒光信號(hào)。 核蛋白GUS酶活定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：pBI—SV40NLS—GFP：：G

5、US植株的核內(nèi)GUS酶活在90-380U之間，明顯高于pBI—GFP：：GUS與其他融合NLS的轉(zhuǎn)基因植株，大約是它們的2-4倍。 2．NLS對(duì)重組酶效率影響的初步研究 進(jìn)一步將已合成的SV40NLS融合至重組酶Cre的N端，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI—CaMV35S—Cre—NOS與pBI—CaMV35S—SV40NLS—Cre—NOS。由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)，二次轉(zhuǎn)化含特異識(shí)別位點(diǎn)的GUS陽(yáng)性煙草pLFGN，獲得二次轉(zhuǎn)化的再生