結合聚合連接反應和磁性分離系統(tǒng)的單核苷酸多態(tài)性檢測方法的建立.pdf

1、隨著大量與人類疾病和藥物治療相關的單核苷酸多態(tài)性(Single-NucleotidePolymorphism，SNP)的發(fā)現，出現了多種對SNP進行檢測的方法和技術。然而，大多數方法由于受到檢測靈敏度低，需要昂貴的實驗設備及試劑，或需要專業(yè)操作人員等方面的限制，無法在常規(guī)的臨床檢驗中推廣使用。
　　 設計特定組成和功能的檢測探針，建立了一種對SNP位點、短片段插入或缺失位點進行分型檢測的新方法。該法主要包括以下幾個步驟：(1)對

2、SNP位點所在片段進行PCR擴增；(2)在DNA聚合酶的延伸作用(Fill-in)和DNA連接酶的連接作用(Ligation)雙重特異性保證的基礎上，對等位基因的檢測位點進行識別；(3)基于磁分離技術的原理，使用鏈親和素磁性微粒對含有檢測位點等位基因特異性片段進行純化，減少反應體系中其它成分對后續(xù)分型檢測的影響，進一步增強檢測體系的特異性。(4)對純化后的等位基因特異性片段進行擴增以增加檢測靈敏度；(5)通過瓊脂糖凝膠電泳、ELISA檢

3、測或通用寡核苷酸芯片技術三種不同方式實現分型檢測。
　　 瓊脂糖凝膠電泳和ELISA檢測實現的分型，不需依靠昂貴的檢測儀器及試劑，即可達到快速、特異性好和靈敏度高等特點，該法能夠在常規(guī)實驗室實現對腫瘤組織等不均一樣本進行低拷貝等位基因的檢測。如果利用通用寡核苷酸芯片技術實現基因分型，可以使用單色熒光標記系統(tǒng)，以簡單的熒光掃描設備和簡便的結果分析方法實現中、高通量的SNP分型檢測。
　　 以苯二異硫氰酸酯(p-phenyl

4、ene diisothiocyanate/1,4-phenylene diisothiocyanate，PDC)作為雙功能交聯劑，對氨基末端磁性微粒的表面進行修飾而制備活化磁性微粒。通過將鏈親和素共價偶聯于活化磁性微粒表面而制備鏈親和素磁性微粒用于SNP分型檢測研究。
　　 用聚合連接反應-瓊脂糖凝膠電泳方法對藥物代謝酶基因CYP3A4、CYP2B6和藥物靶點基因EGFR(Epidermal growth factor rece

5、ptor)的8個SNP位點和一個短片段插入/缺失位點進行了檢測，結果表明，此方法具有很好的特異性和靈敏度，能夠將僅占0.5％比例的突變型等位基因從混合樣本中檢測出來。對35例非小細胞肺癌組織樣本EGFR，c.2573T＞G(L858R)位點的檢測結果顯示，用聚合連接反應-瓊脂糖凝膠電泳方法能夠檢測出8例雜合子樣本，而用常規(guī)的直接測序方法僅能夠檢測出2例雜合子樣本。表明此方法具有較高的靈敏度，適合于對腫瘤等不均一組織樣本的SNP檢測研究。

6、和瓊脂糖凝膠檢測方法相比，8例雜合子樣本的酶聯免疫檢測結果，其陽性和陰性信號的對比結果更為明顯，表明ELISA顯色具有更高的靈敏度，同時可實現更大的通量。
　　 以聚合連接反應-通用寡核苷酸檢測芯片對藥物代謝酶相關SNP檢測的技術進行了初步研究，藥物代謝酶CYP2D6基因上的7個SNP位點進行芯片檢測，各個位點的陽性雜交區(qū)域均具有明顯的熒光信號值，并且具有明顯的陽性和陰性信號對比，顯示了建立的聚合連接反應-通用寡核苷酸芯片檢測方