PD-1及CTLA-4單抗聯(lián)合腫瘤抗原激活IFN-γ陽性效應細胞治療B16惡性黑色素瘤的研究.pdf

1、目的：本實驗通過在C57BL/6小鼠背部注射黑色素瘤細胞使小鼠荷瘤。將來源于小鼠骨髓的原始細胞誘導培養(yǎng)成為成熟的負載黑色素瘤抗原的 DC細胞后與小鼠脾臟來源的淋巴細胞共培養(yǎng)，得到對腫瘤有特異性殺傷作用的T淋巴細胞，然后通過磁珠分選純化獲得能分泌產(chǎn)生IFN-γ的效應細胞，將經(jīng)過磁珠分選得到的效應細胞加入免疫檢查點抑制劑(PD-1和CTLA-4通路抑制劑)共同孵育半小時后，將獲得的效應細胞應用于已經(jīng)荷瘤的小鼠體內(nèi)。檢測經(jīng)過磁珠純化加入免疫檢

2、查點抑制劑的效應T細胞對腫瘤微環(huán)境中的IL-10mRNA、TGF-βmRNA表達的影響，流式檢測小鼠脾臟內(nèi)免疫抑制細胞(Tregs)的變化，相關組織病理切片觀察小鼠輸注效應細胞后有無發(fā)生免疫檢查點抑制劑相關免疫副反應，觀察各組荷瘤小鼠腫瘤體積大小變化情況、荷瘤小鼠生存期，探討免疫效應細胞體外聯(lián)合免疫檢查點抑制劑(PD-1和CTLA-4通路抑制劑)，能否在降低免疫檢查點抑制劑“去剎車效應”而誘發(fā)的自身免疫反應同時進一步提高免疫抗腫瘤效應，

3、以及本聯(lián)合方案在清除腫瘤免疫抑制微環(huán)境方面的作用及意義，為建立新一代具有更高療效的微環(huán)境干擾介導的細胞免疫治療技術提供新的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1、通過體外復蘇培養(yǎng)小鼠的惡性黑色素瘤B16細胞，然后向已經(jīng)脫毛的小鼠背部注射復蘇的B16細胞，使小鼠荷瘤。
　　2、負載B16黑色素瘤全腫瘤抗原的小鼠骨髓來源DC細胞的培養(yǎng)：提取C57BL/6股骨脛骨骨髓細胞，向已經(jīng)貼壁的骨髓細胞中加入鼠源rmIL-4、rmG

4、M-CSF和黑色素瘤細胞裂解后得到的腫瘤抗原，最后通過加入腫瘤壞死因子TNF-α使DC細胞成熟。
　　3、通過磁珠陽性分選獲得效應T淋巴細胞：將C57BL/6小鼠脾臟制備成細胞懸液，在得到的細胞懸液中加入淋巴細胞分離液分離后得到淋巴細胞，得到的淋巴細胞經(jīng)過尼龍毛柱的過濾獲得 T淋巴細胞。T淋巴細胞培養(yǎng)2天后，按比例加入負載腫瘤抗原的成熟DC細胞后混合共培養(yǎng)3-4天，即可得到活化的效應性T淋巴細胞。將得到的活化的效應T淋巴細胞通過磁

5、珠陽性分選方法篩選其中能分泌IFN-γ的效應T淋巴細胞。
　　4、免疫檢查點抑制劑與磁珠分選純化的細胞共孵育：將磁珠分選獲得的分泌IFN-γ陽性的效應T細胞加入PD-1和CTLA-4抑制劑，37°孵育半小時。
　　5、實驗動物分組及治療方法：將已經(jīng)荷瘤的小鼠完全隨機分為3個組，每個組40只。(A組)荷瘤對照組：向?qū)φ战M的荷瘤小鼠鼠尾靜脈注射0.2ml的生理鹽水；(B組)磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑細胞治療組：向荷瘤小鼠鼠尾靜

6、脈注射1×106個/0.2ml磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑的效應T淋巴細胞。(C組)免疫檢查點抑制劑治療組：每只荷瘤小鼠腹腔注射PD-1和CTLA-4抑制劑各20ug。觀察不同治療方法后各組荷瘤小鼠腫瘤體積大小的變化情況及生存期長短。
　　6、在細胞治療后的第1、4、7、10、14天時，每個時間點處死小鼠以便提取各組荷瘤小鼠的腫瘤組織，實時定量RT- PCR法檢測治療后不同時間點的腫瘤組織中IL-10 mRNA、TGF-β mRN

7、A表達的變化，比較通過不同治療方法，荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中不同細胞因子表達的變化情況。
　　7、在細胞治療后的第7天取小鼠的脾臟制備成單細胞懸液，流式技術監(jiān)測治療后小鼠脾臟中Tregs細胞的含量，比較通過不同治療方法，對荷瘤小鼠脾臟中免疫抑制細胞的影響情況。
　　8、分別在細胞治療后的第1、4、7、14天，取小鼠肝、肺和小腸組織制備成病理切片，觀察病理形態(tài)學變化，以及免疫檢查點抑制劑與效應細胞體外共孵育后回輸至小鼠體內(nèi)后是否引

8、起免疫檢查點抑制劑的相關免疫副作用：反應性肝炎，腸炎和肺炎等。
　　結果：
　　1、將處于對數(shù)生長期的5×106個B16惡性黑色素瘤細胞接種于6-8周的小鼠背部皮下，6-7天后小鼠背部接種部位出現(xiàn)明顯的肉眼可見大小為0.5cm的皮下黑色瘤結節(jié)；
　　2、將小鼠骨髓來源DC細胞培養(yǎng)至第6天，鏡下可見細胞由貼壁狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài)，而且細胞由規(guī)則圓形形態(tài)變?yōu)榧毎砻嬗忻虪钔黄鸬某墒斓腄C細胞形態(tài)，說明此時的DC細胞已經(jīng)具備了

9、抗原提呈的能力；
　　3、各組荷瘤小鼠腫瘤體積變化：單純注射PBS的對照組荷瘤小鼠腫瘤生長迅速，給予單純免疫檢查點抑制劑及磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑的效應細胞治療組，小鼠腫瘤生長緩慢，腫瘤生長速度明顯慢于單純荷瘤組小鼠，磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑效應細胞治療組的荷瘤小鼠腫瘤生長速度略慢于單純應用免疫檢查點抑制劑治療組的荷瘤小鼠腫瘤，倆個治療組的小鼠腫瘤生長速度在第7天到第20天相比對照組呈顯著降低的趨勢；
　　4、各組小

10、鼠生存期：A組(荷瘤對照組)，B組(磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑組)，C組(免疫檢查點抑制劑組)各組之間進行生存期長短的比較，各組的生存期差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；
　　5、RT-PCR法檢測治療后不同時間點的小鼠腫瘤組織中IL-10mRNA、TGF-β mRNA表達的變化情況：在磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療組中小鼠腫瘤組織中的IL-10 mRNA、TGF-β mRNA的表達明顯低于荷瘤對照組(P<0.05)，單純應用

11、免疫檢查點抑制劑組也明顯低于荷瘤組(P<0.05)，但是磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療組與單純應用免疫檢查點抑制劑組之間無明顯差別。磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療組中，腫瘤組織中IL-10 mRNA、TGF-βmRNA出現(xiàn)了隨時間增加表達明顯下降的趨勢，三組腫瘤組織中IL-10 mRNA、TGF-βmRNA的表達除了磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療組與單純應用免疫檢查點抑制劑組均存在顯著性差異(P<0.05)；
　　6、細胞流

12、式結果：我們通過流式細胞術檢測了經(jīng)過治療的荷瘤小鼠的脾臟免疫細胞的亞群比例變化。結果我們發(fā)現(xiàn)磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑效應細胞治療和單純應用免疫檢查點治療均有效減少了免疫抑制細胞(Tregs)的比例與絕對數(shù),顯著提高了CD8+T細胞。但是倆個組之間對免疫抑制細胞的抑制作用無明顯差異；
　　7、病理切片結果：磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑組內(nèi)沒有出現(xiàn)反應性肝炎，腸炎和肺炎等免疫檢查點的副反應；單純應用免疫檢查點抑制劑組中部分出現(xiàn)反應

13、性肝炎，腸炎，肺炎和腹瀉等。
　　結論：
　　1、相比于荷瘤對照組，磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑細胞治療組及單純應用免疫檢查點抑制劑組的小鼠腫瘤生長速度在7至25天明顯下降。磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑組的腫瘤生長速度略慢于單純應用免疫檢查點抑制劑組，說明磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑的效應細胞能夠明顯的抑制小鼠腫瘤的生長進展。
　　2、磁珠分選聯(lián)合免疫抑制劑治療與單純免疫檢查點抑制劑治療都能夠有效延長荷瘤小鼠的生存期，

14、磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑細胞治療組的生存期略優(yōu)于免疫檢查點抑制劑組,但是單獨應用免疫檢查點抑制劑有幾率導致免疫相關反應，引起生存期明顯減少。
　　3、磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療后，腫瘤組織中IL-10 mRNA、TGF-βmRNA的表達明顯下降，對IL-10 mRNA和TGF-βmRNA表達的影響與免疫檢查點抑制劑組無統(tǒng)計學差別。
　　4、磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療及單純應用免疫檢查點抑制劑均可以降低小鼠脾臟