DIN10、GHB和SKU5在擬南芥葉片花色素苷合成與降解過程中的作用.pdf

1、花色素苷（Anthocyanins）是植物中一類重要的的多酚類水溶性色素，由花色素苷配基與糖通過糖苷鍵結(jié)合而成。目前關(guān)于植物花色素苷的結(jié)構(gòu)、生物合成途徑、影響花色素苷合成的內(nèi)外因子等的研究已十分詳盡，但關(guān)于植物體內(nèi)花色素苷降解機(jī)制的研究較少。植物的花、果實(shí)、葉片等部位在發(fā)育、成熟和衰老過程中存在普遍的花色素苷褪色降解現(xiàn)象。已有的研究表明，植物體內(nèi)花色素苷降解并非其衰老的一部分，而可能與花色素苷-β-糖苷酶（Anthocyanin-β-g

2、lucosidase）和多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、漆酶（Laccase）等有關(guān)。在植物中，除花色素苷-β-糖苷酶之外，其他的幾個(gè)酶均有一定的研究。本文以擬南芥（Arabidopsis thaliana）為材料，以兩個(gè)糖苷酶基因GHB、DIN10和一個(gè)漆酶基因SKU5為對象，通過觀察目的基因缺失的突變體植株、過表達(dá)目的基因植株的表型，結(jié)合目的基因在花色素苷降解過

3、程中表達(dá)水平的變化，探討了它們在擬南芥葉片花色素苷降解過程中的作用。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.突變體的鑒定和評價(jià)
　　從擬南芥突變體數(shù)據(jù)庫ABRC購買GHB、DIN10和SKU5基因的突變體，進(jìn)行T-DNA插入位點(diǎn)分析，三個(gè)突變體皆是相對理想的T-DNA插入突變體。利用三引物法鑒定獲得了突變體的純合體。
　　2.藍(lán)光誘導(dǎo)過程中和弱光恢復(fù)下花色素苷的含量變化
　　藍(lán)光連續(xù)照射擬南芥突變體和WT幼苗3

4、d，葉片逐漸變紫色，積累部位主要集于在植株葉片背面和莖部。其中突變體葉片紫色程度比WT明顯。3 d停止藍(lán)光處理后移到晝夜交替（16 h光/8 h暗）的弱光下恢復(fù)時(shí)，紫色逐漸消失，5-7 d后紫色完全消失。分別測量7個(gè)取樣點(diǎn)的幼苗花色素苷含量，結(jié)果與藍(lán)光照射的表型一致。藍(lán)光結(jié)束時(shí)，ghb花色素苷含量比WT多70-80％，sku5則比WT多75%左右，din10則是多40-50%。從恢復(fù)期花色素苷降解速率上看，突變體并沒有比WT降解的慢，差

5、異不明顯。
　　3.藍(lán)光誘導(dǎo)花色素苷合成過程中基因表達(dá)的變化
　　基因表達(dá)分析結(jié)果表明，不論是WT還是突變體擬南芥，與藍(lán)光處理前相比，花色素苷合成關(guān)鍵基因（CHS、DFR、ANS和PAP1）都在藍(lán)光照射期間表達(dá)都明顯上調(diào)，而在藍(lán)光結(jié)束后的恢復(fù)期間這些基因表達(dá)都有所降低。此外，糖苷酶基因 BGLU10、BGLU15、漆酶基因 SKU5的表達(dá)會(huì)有些許上調(diào)的現(xiàn)象，而過氧化物酶基因上調(diào)影響最為明顯。在突變體擬南芥中，GHB的突變能增

6、強(qiáng)花色素苷合成基因 ANS、DFR、CHS和 PAP1的表達(dá)而 DIN10和 SKU5基因的缺失對這些基因的表達(dá)影響不明顯。DIN10、GHB和 SKU5這三個(gè)基因的單突變會(huì)一定程度上降低其他糖苷酶基因（BGLU15，DIN10，GHB）的表達(dá)。GHB的單突變能增強(qiáng)SKU5的表達(dá)，而DIN10影響不明顯。GHB和DIN10兩個(gè)基因突變均提高部分過氧化物酶基因（如PER38、PRX、PRX33和PRX34）的表達(dá)，而SKU5基因突變會(huì)降低

7、過氧化物酶基因在藍(lán)光照射期間的表達(dá)。
　　4.弱光恢復(fù)花色素苷降解過程中的基因表達(dá)變化
　　基因表達(dá)分析結(jié)果表明，野生型擬南芥中 BGLU15、DIN10和 GHB三個(gè)糖苷酶基因在花色素苷降解過程中有不同程度的上調(diào)，推測這些糖苷酶在降解花色素苷的過程中可能起一定的作用，它們可能是互相影響的：DIN10突變能非常明顯的提高BGLU15的表達(dá)；GHB突變能明顯提高DIN10的表達(dá)；而DIN10突變卻使GHB的表達(dá)低于同時(shí)期的WT

8、。在WT中，在恢復(fù)的1-5 d內(nèi)，漆酶SKU5基因的表達(dá)逐漸上升，到了7 d轉(zhuǎn)而下降。而如果GHB基因突變，漆酶SKU5基因的表達(dá)則會(huì)在5 d和7 d的時(shí)候明顯上調(diào)。POD基因在野生型擬南芥花色素苷降解的過程中有十幾倍甚至數(shù)十倍的提高，缺失糖苷酶或漆酶會(huì)使他們表達(dá)量在某些時(shí)間點(diǎn)增強(qiáng)到一百多倍，如din10中，PRX33和PRX34的表達(dá)在恢復(fù)1 d和7 d時(shí)上調(diào)100多倍。
　　5.酵母異源表達(dá)目的蛋白的活力及其底物專一性

9、　　GHB和DIN10蛋白都具有降解β-糖苷的活力，經(jīng)不同底物的活力比較發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)糖苷酶降解4-硝基苯β-D-吡喃葡萄糖苷的活力比4-硝基苯的其他糖苷強(qiáng)；此外，DIN10比GHB的β-糖苷酶活力強(qiáng)。
　　6. DIN10和GHB糖苷酶基因在擬南芥中過表達(dá)
　　通過Gateway技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化擬南芥后經(jīng)抗性板篩選、PCR鑒定后得到T3代植株，T3代植株經(jīng)定量PCR分析基因表達(dá)，轉(zhuǎn)DIN10植株獲得2個(gè)

10、株系，其DIN10基因表達(dá)比野生型高20-30倍。
　　本文的主要結(jié)論是：
　　持續(xù)的藍(lán)光處理誘導(dǎo)擬南芥葉片花色素苷的積累，轉(zhuǎn)入晝夜交替弱光恢復(fù)后，花色素苷迅速降解。GHB、DIN10和SKU5等基因在花色素苷降解過程中表達(dá)上調(diào)，暗示這些基因可能在花色素苷降解過程中起一定的作用。這些基因的突變均促進(jìn)擬南芥花色素苷的合成，本文首次發(fā)現(xiàn)糖苷酶 GHB基因突變能明顯誘導(dǎo)花色素苷合成基因在藍(lán)光誘導(dǎo)系統(tǒng)中的表達(dá)。三個(gè)基因的單突變對誘導(dǎo)