Citrostatin的構(gòu)建、表達及活性的研究.pdf

1、本研究通過基因工程方法大量制備新型抗腫瘤融合肽citrostatin，它由柔性肽連接N端的T8(tumstatin69-95)序列和C末端的citropin1.18構(gòu)成。T8(tumstatin69-95)來源于組織中的膠原蛋白Ⅳ，是基底膜Ⅳ型膠原α3鏈C末端的27肽衍生物，通過選擇性地與內(nèi)皮細胞膜上的αvβ3受體結(jié)合，抑制內(nèi)皮細胞的蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制新生血管的形成，進而抑制腫瘤生長。citropin1.18來源于藍嶺樹蛙(

2、Litoriacitropa)的皮腺分泌物，是16個氨基酸殘基組成的活性小分子肽，可通過其C末端帶正電荷的極性氨基酸，與腫瘤細胞膜表層帶負電荷的磷脂(PS)產(chǎn)生靜電引力作用，使多肽聚集于腫瘤細胞膜表面。聚集的多肽呈現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)，非極性的一側(cè)疏水氨基酸借疏水作用伸入細胞膜內(nèi)層，造成膜內(nèi)分子位移、質(zhì)膜穿孔，從而殺傷腫瘤細胞。根據(jù)tumstatin和citropin1.18不同的抗腫瘤機理，經(jīng)生物學(xué)實驗檢測其抑制新生血管及抗腫瘤活性，為ci

3、trostatin成為抗腫瘤藥物提供新的思路和實驗依據(jù)。 本研究內(nèi)容包括：①化學(xué)合成citrostatin48肽粗品，經(jīng)HPLC純化后凍干成干粉，通過生物學(xué)實驗檢驗其抗腫瘤及其抑制新生血管活性。為進一步的理論研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。②克隆citrostatin的融合基因，構(gòu)建其表達載體。③利用基因工程的方法，大量克隆、表達citrostatin的融合蛋白，通過細胞水平及整體水平檢測其抗腫瘤及其抑制新生血管活性。 第一部分ci

4、trostatin的化學(xué)合成及其生物學(xué)活性分析目的：通過人工設(shè)計、合成、純化融合肽citrostatin(48aa)，并對其進行體外活性檢測，了解其是否同時抑制腫瘤新生血管生成和殺傷腫瘤細胞的功能，探討人工融合多個抗腫瘤活性片段的可行性，以便為基因工程大量制備與研究奠定基礎(chǔ)。 方法：融合肽citrostatin由48個氨基酸構(gòu)成，包含2個功能部分：(1)N端的tumstatin(T8)序列。通過選擇性地與內(nèi)皮細胞膜上的αvβ3受

5、體結(jié)合，抑制內(nèi)皮細胞的蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制新生血管的形成，進而抑制腫瘤生長。(2)C端的citropin1.18序列。因其富含正電荷，可以靶向作用于富含負電荷的腫瘤細胞膜表面，通過α-螺旋作用于腫瘤細胞，造成膜內(nèi)分子位移、質(zhì)膜穿孔，殺傷腫瘤細胞。(3)GlyGlyGlyGlySer序列，多聚甘氨基酸肽鏈，具有良好的伸展性和可折疊性，可保持各片斷結(jié)構(gòu)功能域的相對獨立性。根據(jù)以上多肽序列合成的融合肽經(jīng)質(zhì)譜分析MW=5270.03與

6、理論分子量5269.25基本吻合，但純度較低。經(jīng)HPLC純化，凍干成粉末后進行體外生物學(xué)實驗，檢測其抑制新生血管形成和殺傷腫瘤細胞活性。 結(jié)果：citrostatin可明顯抑制內(nèi)皮細胞增殖(ED50約為6.2μg/ml)，殺傷腫瘤細胞，對1990細胞、NCI-H640細胞，citrostatin所需要的ED50的濃度分別為50μg/ml、16μg/ml，并明顯抑制體外管狀結(jié)構(gòu)生成及雞胚絨毛尿囊膜血管的生成。以上實驗都呈現(xiàn)劑量依賴

7、關(guān)系，從細胞水平和半整體水平反映了citrostatin的抗腫瘤活性，提示其同時具有抑制腫瘤組織新生血管形成和直接殺傷腫瘤的雙功能。 結(jié)論：citrostatin同時具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖、管狀結(jié)構(gòu)形成以及抗腫瘤細胞作用。因此，對citrostatin的研究和開發(fā)極有可能為腫瘤治療帶來新的希望。 第二部分citrostatin融合基因的構(gòu)建目的：克隆citrostatin的融合基因，構(gòu)建其表達載體。 方法：融合

8、多肽N端為tumstatin(T8)序列，通過GlyGlyGlyGlySer柔性多肽連接C端citropin1.18序列。按照融合多肽的氨基酸序列通過遺傳密碼在原核生物的偏愛性設(shè)計反向翻譯得到citrostatin融合基因DNA序列。構(gòu)建目的基因：tumstatin(T8)序列的5’端引入.BamHⅠ酶切位點(GGATCC)，citropin1.18片段3’端引入終止密碼子TGA及XhoⅠ(CTCGAG)酶切位點。單鏈寡核苷酸的合成、拼

9、接及克隆到pGEX-4T-3中的過程，委托上海生物工程有限公司進行，因表達產(chǎn)量不理想，故將citrostatincDNA序列重新克隆到表達載體pMAL-c2X中獲得重組質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切和測序鑒定其正確性。 結(jié)果：HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切后得到約160bp大小的目的片段和載體片段，表明目的片段與載體正確連接。測序結(jié)果表明未發(fā)生突變。 結(jié)論：tumstatin(T8)和citropin1.18DNA正確拼接，并能成功構(gòu)建重

10、組質(zhì)粒pMAL-citrostatin。 第三部分citrostatin的克隆、表達及其生物活性研究目的：通過運用基因工程的方法，大量制備新型抗腫瘤肽citrostatin，希望獲得一種雙功能蛋白，利用配體T8和內(nèi)皮細胞上受體αvβ3之間高度特異的相互作用以及帶正電的citropin1.18靶向作用于帶負電的腫瘤細胞，同時特異地殺傷腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞，從而改善其抗腫瘤的活性。 方法：將重組質(zhì)粒pMAL-cit

11、rostatin，轉(zhuǎn)化EcoliBL21(DE3)，高密度發(fā)酵和誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE及WesternBlot法分析該融合蛋白的表達水平。并將大規(guī)模表達的菌體經(jīng)洗滌、裂解、低溫離心以及Amylose樹脂凝膠親和層析等步驟規(guī)模分離純化后，冷凍干燥，得到濃縮蛋白MBP/citrostatin。通過(1)內(nèi)皮細胞增殖抑制試驗(2)細胞毒活性分析(3)體外管狀結(jié)構(gòu)生成抑制實驗(4)裸鼠移植瘤模型抑制腫瘤試驗，檢測MBP/citrostati

12、n在細胞水平、整體水平的抗腫瘤活性。 結(jié)果：SDS-PAGE可見表達的重組蛋白約占菌體總蛋白的20％以上，分子量與理論值一致。此融合蛋白經(jīng)Xa蛋白酶切后，WesternBlot法可見citrostatin基本被切除，只留下與pMAL表達的MBP蛋白大小相似的載體蛋白，說明MBP/citrostatin融合蛋白已經(jīng)成功表達。生物學(xué)檢測證實citrostatin融合蛋白能明顯抑制內(nèi)皮細胞增殖，對內(nèi)皮細胞增殖的抑制呈劑量依賴性，半效抑

13、制濃度為2.6×10-6mol/L，并能殺傷腫瘤細胞。我們用A375細胞接種BALB/cA-nude裸鼠，待成瘤后連續(xù)24d瘤周組織注射citrostatin融合蛋白后(1mg/kg/day，100μl)后，MBP/citrostatin治療組的腫瘤體積小于對照組腫瘤體積的1/2(86±54.8mm3vs192±52.5mm3)，腫瘤生長率也顯著慢于對照組，對照組裸鼠于成瘤1月后，因腫瘤增長過快，死亡；而MBP/citrostatin治