EP3受體在內(nèi)皮源性前列環(huán)素誘發(fā)血管收縮反應(yīng)中的作用.pdf

1、背景和目的:環(huán)氧化酶（COX）主要存在COX-1和COX-2兩種亞型，其催化花生四烯酸（AA）代謝產(chǎn)生具有血管活性的各種前列腺素類物質(zhì)。在心血管系統(tǒng)中，血栓素A2（TxA2）和前列環(huán)素I2（PGI2）被認(rèn)為是具有相反調(diào)節(jié)作用的兩種前列腺素類物質(zhì)。TxA2主要產(chǎn)生于血小板，通過激活血栓烷素（TP）受體調(diào)節(jié)血管收縮和聚集血小板的作用。相反，PGI2主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，通過激活PGI2受體（IP受體）調(diào)節(jié)血管舒張反應(yīng)和拮抗TP受體的作用。

2、來自血管內(nèi)皮的PGI2和血小板產(chǎn)生的TxA2之間作用的失衡將導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，如高血壓等。
　　然而，在一些血管(包括某些人類血管)中，PGI2或者血管內(nèi)皮源性COX的代謝產(chǎn)物（主要由PGI2構(gòu)成）可激活TP受體而引起血管收縮作用。進(jìn)一步的研究表明，TP受體和IP受體都參與調(diào)節(jié)PGI2誘發(fā)的血管反應(yīng)。因此，PGI2或血管內(nèi)皮源性COX代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)的血管收縮活動(dòng)往往反映了IP受體的功能和/或表達(dá)受限，后者可導(dǎo)致顯示出被同時(shí)激

3、活的TP受體所介導(dǎo)的血管收縮作用。然而，在一些血管如小鼠腹主動(dòng)脈，IP受體存在表達(dá)（雖其表達(dá)水平要低于 PGI2誘發(fā)舒張效應(yīng)的血管，如腸系膜動(dòng)脈），加入了 TP受體阻滯劑后PGI2沒有誘發(fā)血管舒張反應(yīng)。另外，在其它一些血管（如大鼠腎動(dòng)脈）中，PGI2或血管內(nèi)皮源性COX代謝產(chǎn)物引起的血管收縮效應(yīng)對(duì)TP受體阻滯劑不甚敏感。因此，我們提出，除了 TP受體之外,可能存在其它前列腺素受體參與 PGI2所誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)。然而，這一機(jī)制的存在及

4、介導(dǎo)該反應(yīng)的受體特性尚有待進(jìn)一步闡明。此外，先前關(guān)于 TP受體介導(dǎo) PGI2誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)主要是基于藥理學(xué)拮抗劑實(shí)驗(yàn)得到的假說。但有報(bào)道表明，TP受體拮抗劑也抑制其它前列腺素或花生四烯酸相關(guān)的代謝產(chǎn)物誘發(fā)的血管收縮效應(yīng)，從而不能排除其非特異性的作用。因此，亦有必要通過基因敲除的方法來闡明 TP受體在PGI2誘導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)中的確切作用。
　　因此，本研究中用Talen的方法制作了C57BL/6小鼠背景的TP受體敲除（TP-/

5、-）小鼠，并分離在正常生理狀態(tài)下對(duì) PGI2表現(xiàn)為血管收縮反應(yīng)的主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和/或腎動(dòng)脈來進(jìn)行生化和/或功能分析。
　　材料與方法:本研究采用8至12周齡、體重25g左右的健康雄性無特定病原體(SPF)級(jí)的C57BL/6野生型小鼠和同基因型背景的TP-/-小鼠進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)和功能分析。DNA測(cè)序和逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)TP-/-小鼠的DNA序列和基因型；小鼠斷尾法測(cè)定C57BL/6野生型小鼠和TP-/-小鼠尾部出血時(shí)間；無創(chuàng)血壓測(cè)量

6、系統(tǒng)檢測(cè)C57BL/6野生型小鼠和TP-/-小鼠平均動(dòng)脈壓；血管環(huán)張力檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè) C57BL/6野生型小鼠和 TP-/-小鼠離體腹主動(dòng)脈、腎動(dòng)脈及頸動(dòng)脈的血管反應(yīng)性；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)內(nèi)皮膽堿能受體激動(dòng)劑乙酰膽堿（ACh）在C57BL/6野生型小鼠和TP-/-小鼠主動(dòng)脈中誘導(dǎo)產(chǎn)生的PGI2代謝產(chǎn)物6-Ket o-PGF1α、TxA2代謝產(chǎn)物TxB2和PGE2的含量水平；蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)C57BL/6野生型小鼠和TP-/-小鼠主動(dòng)脈

7、中EP3受體和FP受體的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)C57BL/6野生型小鼠和TP-/-小鼠主動(dòng)脈中IP受體、FP受體以及EP3受體mRNAs的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.與C57BL/6野生型小鼠相比，DNA測(cè)序顯示TP-/-小鼠外顯子3編碼區(qū)域丟失22 bp片段；RT-PCR亦顯示TP-/-小鼠的TP受體mRNAs在530 bp處缺失；并且，小鼠斷尾法表明TP-/-小鼠尾部出血時(shí)間延長(zhǎng)；TP-/-小鼠平均動(dòng)脈壓未見明顯改變。

8、
　　2.與 C57BL/6野生型小鼠相比，在一氧化氮合成酶抑制劑（L-NAME）預(yù)處理后的TP-/-小鼠腹主動(dòng)脈中，TP受體激動(dòng)劑U46619沒有誘發(fā)任何反應(yīng)；PGI2、PGF2α、PGD2以及 PGE2所誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)也受到大幅度的抑制；PGE2所誘導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)能夠被EP3受體拮抗劑L798106消除，而不被TP受體拮抗劑SQ29548所抑制。
　　3.在苯腎上腺素（PE）預(yù)收縮、L-NAME處理或去內(nèi)皮TP-/

9、-小鼠腹主動(dòng)脈中，PGI2仍誘發(fā)明顯的血管收縮反應(yīng)，該反應(yīng)能夠被EP3受體拮抗劑L798106消除并導(dǎo)致血管舒張效應(yīng)，而EP1受體拮抗劑SC19220沒有誘發(fā)類似反應(yīng)；同時(shí)，EP3受體拮抗劑L798106也能夠抑制PGE2誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)，而EP1受體拮抗劑SC19220亦沒有引起類似反應(yīng)。
　　4.與C57BL/6野生型小鼠相比，在L-NAME預(yù)處理的TP-/-小鼠腹主動(dòng)脈中，ACh誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)大部分消失；PE預(yù)收縮后，

10、ACh誘發(fā)血管舒張反應(yīng)，但該舒張反應(yīng)被一對(duì)非選擇性 COX抑制劑吲哚美辛敏感的雙相收縮反應(yīng)所減弱，EP3受體拮抗劑L798106消除該雙相收縮反應(yīng)，并引起比吲哚美辛存在的情況下更大幅度的舒張作用；IP受體拮抗劑CAY10441能消除EP3受體拮抗劑L798106對(duì)ACh誘發(fā)舒張反應(yīng)的增強(qiáng)作用。另外，在拮抗TP受體的C57BL/6野生型小鼠腹主動(dòng)脈中EP3受體拮抗劑L798106對(duì)ACh誘發(fā)的血管反應(yīng)也發(fā)揮類似作用，且該作用被吲哚美辛減弱

11、。
　　5.與C57BL/6野生型小鼠類似，在TP-/-小鼠主動(dòng)脈中，ACh刺激PGE2和PGI2代謝產(chǎn)物6-Keto-PGF1合成增加，而TxA2代謝產(chǎn)物TxB2的含量未見明顯增加。
　　6.在 C57BL/6野生型小鼠和 TP-/-小鼠腹主動(dòng)脈中，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)到 EP3受體和 FP受體存在表達(dá)，兩者的表達(dá)水平在兩組小鼠間無明顯差異；同時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR同樣檢測(cè)到IP受體、FP受體和EP3受體mRNAs的表達(dá)，各受

12、體的表達(dá)水平在兩組小鼠間亦無明顯差異。另外，C57BL/6野生型小鼠主動(dòng)脈EP3受體的蛋白表達(dá)在去內(nèi)皮后無明顯改變。
　　7.在L-NAME處理的C57BL/6野生型小鼠腹主動(dòng)脈中，PGI2誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)被 EP3受體拮抗劑L798106明顯抑制；PE預(yù)收縮后，PGI2在 TP受體拮抗劑 SQ29548存在的情況下誘導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)被 EP3受體拮抗劑 L798106逆轉(zhuǎn)成血管舒張效應(yīng)，且該舒張效應(yīng)能夠被 IP受體拮抗劑CAY

13、10441減弱。同樣，PE預(yù)收縮及TP受體拮抗后， EP3受體拮抗劑L798106對(duì)COX底物花生四烯酸所誘發(fā)的血管反應(yīng)亦起到同樣的作用，且該作用被IP受體拮抗劑CAY10441所減弱。
　　8.在L-NAME處理的C57BL/6野生型小鼠腹主動(dòng)脈中，PGE2和ACh所誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)能夠被EP3受體拮抗劑L798106或TP受體拮抗劑SQ29548抑制，但與TP受體拮抗劑SQ29548相比，EP3受體拮抗劑L798106對(duì)PG