內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)旁分泌對肺動脈合成前列環(huán)素的影響及機制的研究.pdf

1、背景和目的
　　 特發(fā)性肺動脈高壓(Idiopathicpulmonaryarteryhypertension，IPAH，原名原發(fā)性肺動脈高壓)是一種惡性肺血管疾病，其基本病理特點是遠端肺小動脈內(nèi)膜增生、叢樣病變、中膜肥厚、肌化和血栓形成，管腔逐漸閉塞，肺動脈壓進行性升高，最終導(dǎo)致右心衰竭。近年來，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞在肺動脈高壓(PAH)的形成和發(fā)展中的作用倍受關(guān)注，認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、代謝的改變是PAH發(fā)展、演變中重

2、要的特征。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、激活及合成的多種因子，參與了肺血管的過度收縮與重構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，釋放一氧化氮(Nitricoxide，NO)、前列環(huán)素(Prostacyclin，PGI2)等血管舒張物質(zhì)減少，而釋放內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)、血管緊張素(Angiotensin，Ang)等血管收縮物質(zhì)增多。因此，恢復(fù)內(nèi)皮依賴性的血管舒張物質(zhì)與收縮物質(zhì)之間的平衡是治療PAH的病理生理基礎(chǔ)。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelia

3、lprogenitorcells，EPC)是一類能分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，不僅參與人胚胎血管生成，同時也參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。近年來，EPC移植治療PAH引起國內(nèi)外學(xué)者極大的興趣，已成為一個新的研究熱點。動物實驗顯示EPC移植可以減輕PAH大鼠、犬的肺動脈壓力。我們在動物實驗的基礎(chǔ)上開展了世界上首個EPC移植IPAH患者的臨床試驗研究，結(jié)果顯示EPC移植治療IPAH是有效而安全的。但移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)的作用

4、機制目前尚不明確。既往研究大多認(rèn)為是移植細(xì)胞直接參與血管生成和內(nèi)皮修復(fù)。但是PAH患者肺組織本身不乏血管新生，且部分患者有內(nèi)皮過度增生(叢樣病變)，因而血管新生可能不足以完全解釋移植細(xì)胞對病損肺血管的保護效應(yīng)。因此，本研究目的是探討骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(Bonemarrowderivedendothelialprogenitorcells，BMEPC)是否可以通過旁分泌機制促進血管內(nèi)皮依賴性的血管舒張物質(zhì)的生成，從而發(fā)揮對PAH肺血管的保

5、護效應(yīng)，并進一步明確其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　 實驗方法
　　 采用密度梯度離心法從大鼠骨髓中獲取單個核細(xì)胞，經(jīng)分離純化接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)7天后，收集貼壁細(xì)胞并染色鑒定BMEPC。采用ELISA檢測BMEPC條件培養(yǎng)基(Conditionedmedium，CM)中血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactors，VEGF)的水平。
　　 在體外實驗中，F(xiàn)3

6、44雄性大鼠50只，隨機取10只分為對照組，余40只采用野百合堿(Monocrotaline，MCT60mg/kg)劑量一次性腹腔注射，以誘導(dǎo)大鼠慢性PAH模型，在注射21天后用右心測壓導(dǎo)管檢測右心室收縮壓(Rightheartsystolicpressure，RVSP)的變化，以鑒定慢性PAH大鼠模型。PAH大鼠肺動脈環(huán)經(jīng)BMEPC或BMEPC-CM孵育后，用血管環(huán)灌流實驗觀察血管反應(yīng)性的改變，用Westernblot法檢測環(huán)加氧酶-

7、2(Cyclooxygenase-2，COX-2)、環(huán)加氧酶-1(Cyclooxygenase-1，COX-1)、PGI2合酶(Prostacyclinsynthase，PGIS)的蛋白表達，以及放免法檢測細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷(Cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)的水平。
　　 在體內(nèi)實驗中，雄性大鼠60只，隨機取15只分為假手術(shù)對照組，余45只用MCT誘導(dǎo)大鼠慢性PAH模型，21天后隨機分為BMEPC

8、移植組(n=15)：標(biāo)記綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的BMEPC經(jīng)頸靜脈移植入PAH大鼠肺循環(huán)中；BMEPC-CM移植組：(n=15)；和Medium199(M199)培養(yǎng)基移植組：(n=15)；假手術(shù)對照組用M199注射。細(xì)胞移植21天后，檢測體重、RVSP、肺/體重(Lung/BodyWeight，L/BW)、右心室/左心室+室間隔(Rightventricular/leffventricu

9、larandseptumweight，RV/LV+IVS)及形態(tài)學(xué)改變；采用Westernblot法檢測COx-2、COX-1、PGIS、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(EndothelialNOsynthase，eNOS)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(InducibleNOsynthase，iNOS)的蛋白表達；采用ELISA法及放免法分別檢測6-酮-前列腺素-Flα(6-keto-ProstaglandinFlα，6-keto-PGF1α)、血栓素B2

10、(ThromboxaneB2，TXB2)、前列腺素E2(ProstaglandinE2，PGE2)及cAMP水平；采用免疫組化檢測COX-2蛋白在肺動脈中的表達及分布。
　　 結(jié)果
　　 在體外實驗中，大鼠在MCT注射21天后與正常對照組相比，出現(xiàn)體重減輕、活動度下降、呼吸急促等表現(xiàn)。經(jīng)檢測，BMEPC-CM中的VEGF濃度明顯高于對照組骨髓源性單個核細(xì)胞條件培養(yǎng)基(Bonemarrowderivedmononuclea

11、rcells-conditionedmedium，BMMNC-CM)。肺動脈經(jīng)BMEPC孵育24小時后，內(nèi)皮依賴性血管舒張功能明顯改善，且被COX-2抑制劑--NS398抑制。BMMNC孵育后未改善血管舒張功能。Westernblot檢測顯示：BMEPC及BMEPC-CM孵育后COX-2、PGIS的蛋白表達明顯增加，而COX-1的蛋白表達在各組間無明顯差異。
　　 BMEPC孵育提高肺血管細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。
　　 在體

12、內(nèi)實驗中，MCT注射42天后體重與正常對照組相比明顯減輕(265.17±4.48gvs.329.33±15.18g，P<0.01)；RVSP明顯高于正常對照組(62.37±1.98mmHgvs.25.42±0.95mmHg，P<0.01)；RV/IV+IVS與正常對照組相比明顯增高(0.59±0.03vs.0.26+0.03，P<0.01)；L/BW與正常對照組相比也明顯增高。移植BMEPC未能使體重增加，但顯著降低RVSP、RV/LV

13、+IVS及L/BW。組織病理學(xué)檢查顯示：MCT組大鼠的細(xì)支氣管旁的小肺動脈中膜嚴(yán)重增厚，管腔幾近閉塞，而BMEPC組小肺動脈中膜增厚明顯減輕。Westernblot檢測顯示：與正常對照組相比，MCT組COX-2、PGIS、eNOS的蛋白表達下調(diào)，而COX-1及iNOS的蛋白表達在各組間無明顯差異。移植BMEPC及BMEPC-CM能增加COX-2、PGIS的蛋白表達，并提高6-keto-PGF1α及cAMP水平。免疫組化檢測顯示：MCT組