桿狀病毒基因組掃描技術(shù)篩選病毒因子和順式元件及其表達系統(tǒng)的應(yīng)用.pdf

1、本文利用補齊法構(gòu)建了BmNPV基因組隨機文庫。將BmNPVDNA用Sau3AⅠ部分酶切，用SalⅠ完全消化質(zhì)粒載體pUC19，分別以Klenow酶半補齊，連接、轉(zhuǎn)化后得到覆蓋率大于99.9％的文庫。 通過與文庫質(zhì)粒DNA逐個共轉(zhuǎn)染，鑒定了作用于早期基因helicase啟動子的反式激活因子。篩選出的質(zhì)粒均含有完整的ie-1基因。PCR克隆出ie-1基因共轉(zhuǎn)染即可產(chǎn)生反式激活作用。為證實文庫篩選的可靠性，分別克隆了其它主要早期基因并

2、證實產(chǎn)物均不能對helicase啟動子產(chǎn)生反式激活作用。瞬時表達分析表明，IE-1還可以對其它不同來源的啟動子產(chǎn)生強烈的反式激活。 BmNPVhr3增強子的質(zhì)粒不能激活另一報告質(zhì)粒上的luc基因表達，但當(dāng)細胞受到病毒感染時，便會強烈增強報告基因的表達。利用分別含有hr3的質(zhì)粒、helicase啟動子與luc基因的報告質(zhì)粒和每個BmNPV隨機文庫質(zhì)粒的DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細胞，結(jié)果顯示桿狀病毒的必需因子IE-1介導(dǎo)了hr3增強子在Bm

3、細胞中的反式激活作用。進一步研究還證明IE-1因子作為蛋白質(zhì)橋梁能使增強子對不同來源的啟動子發(fā)揮廣譜性的反式作用。這種增強子的反式作用一般能使轉(zhuǎn)錄活性提高40-100多倍。30bp回文序列是hr增強子反式激活中起作用的基本單元。 利用文庫共轉(zhuǎn)染篩選時發(fā)現(xiàn)一個較小的質(zhì)粒能反式激活轉(zhuǎn)錄幾十倍，其不包含任何病毒早期基因，但包含ie-1基因的5’側(cè)翼非編碼序列直至起始密碼子上游19bp處。瞬時表達證實378bp的ie-1啟動子序列能反式

4、增強啟動子轉(zhuǎn)錄40-100倍，說明此378bpie-1啟動子中存在編碼某個因子或存在某未知調(diào)控方式的一段序列。將此378bpie-1啟動子分為不同長度片段以及定點突變證明并非編碼因子造成這種反式激活。推測這種轉(zhuǎn)錄激活現(xiàn)象是增強序列的反式作用，而介導(dǎo)這種反式作用的蛋白是來源于宿主的細胞因子。將一段238bp序列分別順式連接于報告質(zhì)粒的啟動子上游或報告基因的下游后發(fā)現(xiàn)其可以不分正反，不分上下游并能遠距離的增強目的啟動子轉(zhuǎn)錄10,000倍以上

5、。為了檢測此非同源重復(fù)區(qū)增強子(non-homologousregionenhancer,NHE)對不同啟動子的增強活性，將其分別順式連接至桿狀病毒晚期啟動子和哺乳動物病毒來源的啟動子，發(fā)現(xiàn)NHE對它們都能發(fā)揮很強的增強作用。另外，通過構(gòu)建同時含有同源重復(fù)和非同源重復(fù)這兩種類型增強子的報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后證實兩種類型增強子能夠協(xié)同作用于報告基因的轉(zhuǎn)錄。 通過將桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中的polyhedrin啟動子替換為ie-1啟動子，利用op