桿狀病毒基因組掃描技術(shù)篩選病毒因子和順式元件及其表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用.pdf

1、本文利用補(bǔ)齊法構(gòu)建了BmNPV基因組隨機(jī)文庫。將BmNPVDNA用Sau3AⅠ部分酶切，用SalⅠ完全消化質(zhì)粒載體pUC19，分別以Klenow酶半補(bǔ)齊，連接、轉(zhuǎn)化后得到覆蓋率大于99.9％的文庫。 通過與文庫質(zhì)粒DNA逐個(gè)共轉(zhuǎn)染，鑒定了作用于早期基因helicase啟動(dòng)子的反式激活因子。篩選出的質(zhì)粒均含有完整的ie-1基因。PCR克隆出ie-1基因共轉(zhuǎn)染即可產(chǎn)生反式激活作用。為證實(shí)文庫篩選的可靠性，分別克隆了其它主要早期基因并

2、證實(shí)產(chǎn)物均不能對helicase啟動(dòng)子產(chǎn)生反式激活作用。瞬時(shí)表達(dá)分析表明，IE-1還可以對其它不同來源的啟動(dòng)子產(chǎn)生強(qiáng)烈的反式激活。 BmNPVhr3增強(qiáng)子的質(zhì)粒不能激活另一報(bào)告質(zhì)粒上的luc基因表達(dá)，但當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染時(shí)，便會(huì)強(qiáng)烈增強(qiáng)報(bào)告基因的表達(dá)。利用分別含有hr3的質(zhì)粒、helicase啟動(dòng)子與luc基因的報(bào)告質(zhì)粒和每個(gè)BmNPV隨機(jī)文庫質(zhì)粒的DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，結(jié)果顯示桿狀病毒的必需因子IE-1介導(dǎo)了hr3增強(qiáng)子在Bm

3、細(xì)胞中的反式激活作用。進(jìn)一步研究還證明IE-1因子作為蛋白質(zhì)橋梁能使增強(qiáng)子對不同來源的啟動(dòng)子發(fā)揮廣譜性的反式作用。這種增強(qiáng)子的反式作用一般能使轉(zhuǎn)錄活性提高40-100多倍。30bp回文序列是hr增強(qiáng)子反式激活中起作用的基本單元。 利用文庫共轉(zhuǎn)染篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)較小的質(zhì)粒能反式激活轉(zhuǎn)錄幾十倍，其不包含任何病毒早期基因，但包含ie-1基因的5’側(cè)翼非編碼序列直至起始密碼子上游19bp處。瞬時(shí)表達(dá)證實(shí)378bp的ie-1啟動(dòng)子序列能反式

4、增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄40-100倍，說明此378bpie-1啟動(dòng)子中存在編碼某個(gè)因子或存在某未知調(diào)控方式的一段序列。將此378bpie-1啟動(dòng)子分為不同長度片段以及定點(diǎn)突變證明并非編碼因子造成這種反式激活。推測這種轉(zhuǎn)錄激活現(xiàn)象是增強(qiáng)序列的反式作用，而介導(dǎo)這種反式作用的蛋白是來源于宿主的細(xì)胞因子。將一段238bp序列分別順式連接于報(bào)告質(zhì)粒的啟動(dòng)子上游或報(bào)告基因的下游后發(fā)現(xiàn)其可以不分正反，不分上下游并能遠(yuǎn)距離的增強(qiáng)目的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄10,000倍以上

5、。為了檢測此非同源重復(fù)區(qū)增強(qiáng)子(non-homologousregionenhancer,NHE)對不同啟動(dòng)子的增強(qiáng)活性，將其分別順式連接至桿狀病毒晚期啟動(dòng)子和哺乳動(dòng)物病毒來源的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)NHE對它們都能發(fā)揮很強(qiáng)的增強(qiáng)作用。另外，通過構(gòu)建同時(shí)含有同源重復(fù)和非同源重復(fù)這兩種類型增強(qiáng)子的報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后證實(shí)兩種類型增強(qiáng)子能夠協(xié)同作用于報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。 通過將桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中的polyhedrin啟動(dòng)子替換為ie-1啟動(dòng)子，利用op