桿狀病毒基因連續(xù)缺失方法的建立及其應(yīng)用于初級感染因子功能研究.pdf

1、通過在桿狀病毒基因組中對基因進行缺失構(gòu)建基因缺失突變體病毒是研究基因功能的主要方法之一。傳統(tǒng)的桿狀病毒基因缺失方法以在昆蟲細胞宿主內(nèi)同源重組方式為主，通過構(gòu)建含同源重組臂和合適篩選標記的重組載體和目標病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染進宿主昆蟲細胞，借助昆蟲細胞內(nèi)自身重組酶進行同源重組，利用篩選標記獲得目標缺失型病毒。然而該方法重組效率非常低(0.1％-1％)，需要多輪空斑純化(3-5輪)才能獲得目標病毒，因此復(fù)雜費時。在研究功能相關(guān)基因時，經(jīng)常需

2、要依次缺失數(shù)個基因，傳統(tǒng)方法由于篩選標記有限，重組效率低下，篩選過程復(fù)雜等限制幾乎難以進行多個基因缺失。由桿狀病毒基因改造而成的Bacmid可以在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制生存，因此在細菌內(nèi)進行基因缺失獲得基因缺陷型重組Bacmid變得相對簡單。借助red重組系統(tǒng)和抗生素篩選標記，在細菌內(nèi)缺失目標基因效率得以顯著提高，操作相對簡單快速。由于抗生素標記畢竟有限，所以在連續(xù)缺失基因時依然顯得不夠理想。此外，由于篩選標記基因相對較大(約1000bp)，在

3、重組進基因組中容易造成鄰位效應(yīng)而影響旁邊基因功能，從而使得研究結(jié)果可能發(fā)生一定的誤差。因此通過正反向篩選方法，在缺失目標基因后，將篩選標記去掉，實現(xiàn)無縫缺失，對精確研究基因功能具有較大意義。由于正反向篩選可以連續(xù)使用同一個篩選標記，去掉篩選標記后也不會在基因組內(nèi)留下多余堿基，因此是一種應(yīng)用廣泛的在細菌內(nèi)缺失BAC(細菌人工染色體)上靶標基因的方法。目前使用的正反向篩選標記有ThyA和galk系統(tǒng)，其基本原理比較類似。即首先通過設(shè)計含50

4、bp同源重組臂的引物，擴增出含同源臂的thyA或galK基因，將此PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化進能thyA或者galk缺陷型宿主大腸桿菌，在red重組酶介導(dǎo)下含重組臂的thyA或galk基因置換掉BAC中目的基因，導(dǎo)致陽性菌落能夠在不補加胸腺嘧啶或者半乳糖的基本培養(yǎng)基中生長。在成功置換掉目的基因后，需要利用反向篩選物將篩選標記基因剔除。使用重疊PCR方法(overlapping)將原先左右各50bp同源臂連接成100bp產(chǎn)物，經(jīng)電轉(zhuǎn)化宿主菌，在重組

5、酶的介導(dǎo)下將篩選標記基因thyA或者galk置換出來，陽性菌落可以再補加了方向篩選物的培養(yǎng)基上生長，從而去掉篩選基因。通過這樣一個2次重組，篩選標記可以多次使用。這種正反向篩選的重組效率可以達到70-80％左右，由于需要電轉(zhuǎn)化PCR產(chǎn)物，重疊PCR等過程，其實際效率和操作稍顯繁瑣復(fù)雜，因此在連續(xù)缺失多個基因時依然比較耗時。因此有必要對連續(xù)缺失方法做進一步改進，使其效率最大化，為研究桿狀病毒基因功能提供高效方法。 本研究利用細菌間

6、結(jié)合轉(zhuǎn)移，條件復(fù)制型質(zhì)?？寺CR產(chǎn)物，I-SCEI線性化供體載體，細菌間同源重組，galk，ThyA，rspl正反向篩選技術(shù)建立高效基因連續(xù)缺失方法。首先構(gòu)建出能夠克隆PCR產(chǎn)物的條件復(fù)制型多功能R6k-T載體，該載體即可以克隆3’A產(chǎn)物(常規(guī)Taq)，也可以克隆平末端PCR產(chǎn)物(PFU酶)，該載體使用R6kY復(fù)制子，含2個I-sceI位點，只能在表達pir菌株中生存(Bw23474或者Bun20)，無法在常規(guī)宿主菌中復(fù)制與存活。PC

7、R產(chǎn)物克隆到T載體中，通過結(jié)合轉(zhuǎn)移方式進入Bacmid宿主菌。Bacmid宿主菌為通過改造的能表達I-SECI歸位酶的galk缺陷型宿主菌，在阿拉伯糖誘導(dǎo)下，所表達的歸位酶能夠線性化T載體，釋放出所攜帶的同源重組臂與篩選標記基因。42度誘導(dǎo)下，產(chǎn)生red-gam重組酶，介導(dǎo)篩選標記基因與Bacmid目的片段發(fā)生同源重組，陽性重組菌落能夠在基本培養(yǎng)基上生長。通過合適酶切位點(Bsu36I)切除篩選標記并自聯(lián)，只保留100bp同源重組臂。再

8、次通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入陽性重組菌，通過誘導(dǎo)I-sceI線性化載體，高溫誘導(dǎo)RED重組酶發(fā)生同源重組去掉Bacmid中的篩選標記，并通過補加反向篩選化合物的平板進行篩選。如此可以達到循環(huán)使用篩選標記來連續(xù)缺失多個基因，并且該方法不需要電轉(zhuǎn)化PCR產(chǎn)物，不需要二次重疊PCR，直接利用結(jié)合轉(zhuǎn)移方式傳送DNA片段，操作方便快速，重組效率增加到90％以上。尤其在連續(xù)缺失3個以上基因能夠充分發(fā)揮其優(yōu)勢，為研究由多個基因控制的生物功能提供最佳方