在基因組水平上研究桿狀病毒AcMNPV的變化速度和模式.pdf

1、桿狀病毒(baculovirus)是一類在自然界中僅感染節(jié)肢動(dòng)物的病毒，其作為病毒殺蟲劑、外源基因表達(dá)載體已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中。但是桿狀病毒在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞傳代增殖過程中，其基因組發(fā)生了一些變化，如：點(diǎn)突變，缺失突變，重排突變，倒轉(zhuǎn)突變，導(dǎo)致其病毒產(chǎn)量和毒力下降，這成為了桿狀病毒應(yīng)用的瓶頸問題。 本文在基因組水平上分析了桿狀病毒模式種——苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographacaliforn

2、icamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV)在宿主細(xì)胞增殖時(shí)基因組的變化速度與模式。以一株具有AcMNPV全基因組，既能感染宿主又可以像質(zhì)粒一樣在E.coli中復(fù)制，還具有口服感染能力的重組病毒AcBACph為初始病毒株，選擇可增殖AcMNPV的四齡粉紋夜蛾幼蟲及其來(lái)源的細(xì)胞系Hi-5和草地貪夜蛾細(xì)胞系Sf-9，分別在體內(nèi)和體外進(jìn)行AcBACph的無(wú)稀釋連續(xù)傳代增殖。將提取的子代病毒DNA轉(zhuǎn)化E.coi

3、l，在瓊脂糖平板上分離單菌落，每個(gè)菌落中的質(zhì)粒DNA即為一個(gè)子代病毒基因型。對(duì)于每個(gè)宿主來(lái)源的第1、5、10代，隨機(jī)挑選100個(gè)菌落，共得到900個(gè)子代病毒基因型。對(duì)這900個(gè)子代病毒進(jìn)行了五種限制性內(nèi)切酶(PstⅠ、NdeⅠ、BglⅠ、SacⅡ、EcoRV)的酶切條帶分析，并在生物信息學(xué)軟件DNAStar、VectorNTI9.0輔助下初步構(gòu)建了這900個(gè)子代病毒的物理圖譜。 根據(jù)這900個(gè)子代病毒的物理圖譜得出了每個(gè)子代病毒

4、遺傳信息的缺失率(這里指每個(gè)子代病毒缺失的ORF、hr、non-hr占全基因組中所有ORF、hr、non-hr的比例)和不同子代病毒群體的每個(gè)ORF、hr、non-hr的缺失頻率(指每代宿主中缺失此ORF、hr、non-hr的突變體占此代宿主中全部突變體的比例)。發(fā)現(xiàn)AcBACph在Hi-5細(xì)胞中和四齡粉紋夜蛾幼蟲中連續(xù)傳代后，所產(chǎn)生的子代病毒的每一個(gè)ORF、hr、non-hr的缺失頻率在傳代過程中都呈現(xiàn)一種由高到低的趨勢(shì)，其子代病毒遺

5、傳信息的缺失率也呈現(xiàn)一種由高到低的趨勢(shì)；而在Sf-9細(xì)胞中子代病毒的每一個(gè)ORF、hr、non-hr的缺失頻率在傳代過程中變化不明顯，其子代病毒遺傳信息的缺失率變化也不明顯，這些表明了桿狀病毒在連續(xù)傳代過程中其基因組的變化具有宿主特異性。 選取缺失率均在10％以內(nèi)的10個(gè)子代病毒，其中有些缺失了部分病毒DNA復(fù)制的必需因子。將它們分別轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞、Hi-5細(xì)胞，其子代芽生型病毒產(chǎn)量、多角體產(chǎn)量以及超微病理觀察表明：雖然遺傳信