在基因組水平上研究桿狀病毒AcMNPV的變化速度和模式.pdf

1、桿狀病毒(baculovirus)是一類在自然界中僅感染節(jié)肢動物的病毒，其作為病毒殺蟲劑、外源基因表達載體已被廣泛應用于生命科學各個領域的基礎研究和應用研究中。但是桿狀病毒在昆蟲培養(yǎng)細胞傳代增殖過程中，其基因組發(fā)生了一些變化，如：點突變，缺失突變，重排突變，倒轉(zhuǎn)突變，導致其病毒產(chǎn)量和毒力下降，這成為了桿狀病毒應用的瓶頸問題。 本文在基因組水平上分析了桿狀病毒模式種——苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographacaliforn

2、icamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV)在宿主細胞增殖時基因組的變化速度與模式。以一株具有AcMNPV全基因組，既能感染宿主又可以像質(zhì)粒一樣在E.coli中復制，還具有口服感染能力的重組病毒AcBACph為初始病毒株，選擇可增殖AcMNPV的四齡粉紋夜蛾幼蟲及其來源的細胞系Hi-5和草地貪夜蛾細胞系Sf-9，分別在體內(nèi)和體外進行AcBACph的無稀釋連續(xù)傳代增殖。將提取的子代病毒DNA轉(zhuǎn)化E.coi

3、l，在瓊脂糖平板上分離單菌落，每個菌落中的質(zhì)粒DNA即為一個子代病毒基因型。對于每個宿主來源的第1、5、10代，隨機挑選100個菌落，共得到900個子代病毒基因型。對這900個子代病毒進行了五種限制性內(nèi)切酶(PstⅠ、NdeⅠ、BglⅠ、SacⅡ、EcoRV)的酶切條帶分析，并在生物信息學軟件DNAStar、VectorNTI9.0輔助下初步構建了這900個子代病毒的物理圖譜。 根據(jù)這900個子代病毒的物理圖譜得出了每個子代病毒

4、遺傳信息的缺失率(這里指每個子代病毒缺失的ORF、hr、non-hr占全基因組中所有ORF、hr、non-hr的比例)和不同子代病毒群體的每個ORF、hr、non-hr的缺失頻率(指每代宿主中缺失此ORF、hr、non-hr的突變體占此代宿主中全部突變體的比例)。發(fā)現(xiàn)AcBACph在Hi-5細胞中和四齡粉紋夜蛾幼蟲中連續(xù)傳代后，所產(chǎn)生的子代病毒的每一個ORF、hr、non-hr的缺失頻率在傳代過程中都呈現(xiàn)一種由高到低的趨勢，其子代病毒遺

5、傳信息的缺失率也呈現(xiàn)一種由高到低的趨勢；而在Sf-9細胞中子代病毒的每一個ORF、hr、non-hr的缺失頻率在傳代過程中變化不明顯，其子代病毒遺傳信息的缺失率變化也不明顯，這些表明了桿狀病毒在連續(xù)傳代過程中其基因組的變化具有宿主特異性。 選取缺失率均在10％以內(nèi)的10個子代病毒，其中有些缺失了部分病毒DNA復制的必需因子。將它們分別轉(zhuǎn)染Sf-9細胞、Hi-5細胞，其子代芽生型病毒產(chǎn)量、多角體產(chǎn)量以及超微病理觀察表明：雖然遺傳信