雙鹵西林酰胺類衍生物的設(shè)計(jì)、合成及免疫抑制活性的初步研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著自身性免疫疾病患者以及器官移植手術(shù)對(duì)免疫抑制劑需求量的增多，急需一種低毒高效且易生產(chǎn)的新型藥物出現(xiàn)。免疫抑制劑用于臨床治療免疫性疾病已經(jīng)多年，可是目前臨床上各種免疫抑制劑的毒副作用都比較嚴(yán)重，并且與有效治療劑量非常地接近。雷帕霉素（Rapamycin）作為當(dāng)前最有治療效果的免疫抑制劑，同時(shí)也是最早發(fā)現(xiàn)的一類mTOR抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路和免疫有著密切的關(guān)系，mTOR抑制劑主要通過(guò)減少T細(xì)胞中細(xì)胞因子受體的mRNA合

2、成從而阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)，如白介素IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、CSF、PDGF和IGF,阻斷T細(xì)胞由G1期至S期，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用。但是雷帕霉素的水溶性差、合成成本高、生物利用率低（<15％），因此本研究把目光轉(zhuǎn)向能夠克服以上缺點(diǎn)的小分子mTOR抑制劑上。本研究前期利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)手段（CADD），利用虛擬篩選方法以mTOR蛋白為受體得到雙鹵西林酰胺先導(dǎo)化合物；隨后運(yùn)用逆向分析全合成的方法，合成出具有免疫抑制

3、活性的一系列雙鹵西林酰胺類衍生物。隨后通過(guò)體內(nèi)外生物活性實(shí)驗(yàn)證明了藥物設(shè)計(jì)的合理性，并篩選出一種高活性的mTOR免疫抑制劑。最后結(jié)合反向?qū)优c藥效團(tuán)模型為下一步獲得高效低毒的臨床免疫抑制劑提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴運(yùn)用Sybyl2.0X，配體分子從ZINC和PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中下載，以mTOR作為受體和近200萬(wàn)個(gè)小分子進(jìn)行虛擬篩選，最終得到先導(dǎo)化合物。⑵采用分子對(duì)接方法模擬先導(dǎo)化合物在 mTOR受體中的作

4、用模式，分析化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的潛在關(guān)系，設(shè)計(jì)新的雙鹵西林酰胺類衍生物。⑶這個(gè)過(guò)程使用逆向全合成方法，根據(jù)最科學(xué)的合成方案得到一系列雙鹵西林酰胺類衍生物。通過(guò)核磁共振氫譜/碳譜（1H-NMR/13C-NMR）以及液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)，鑒定其結(jié)構(gòu)。⑷體外活性：基于CCK-8技術(shù)，測(cè)定所合成的化合物對(duì)于T淋巴細(xì)胞系的急性白血病細(xì)胞Jurkat的體外抑制活性，篩選出活性最高的化合物做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；利用Western blotting方法檢測(cè)

5、經(jīng)小分子抑制劑處理后細(xì)胞蛋白水平的表達(dá)。體內(nèi)活性：用ΔLM-OVA標(biāo)記的李斯特菌使 C57B1/6小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答后，給小鼠通過(guò)灌胃方式服用上述化合物。7天之后，取小鼠尾靜脈外周血并分離 T淋巴細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CD8+IFN-γ+T細(xì)胞占整個(gè)淋巴細(xì)胞的比例，以此鑒定化合物的體內(nèi)生物活性。⑸利用在線免費(fèi)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Pharm Mapper讓配體化合物與7000多種蛋白受體相互作用，反釣出靶點(diǎn)蛋白以此預(yù)測(cè)目標(biāo)分子的毒副作用。⑹

6、收集9種雙鹵西林酰胺類衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和體外生物活性數(shù)據(jù)，以此構(gòu)建一個(gè)藥效團(tuán)模型，并基于藥效團(tuán)模型進(jìn)行3D-QSAR分析。
　　本研究表明：①虛擬篩選確定了3-(2,6-二氯苯基)-5-甲基-N-2-(6-甲磺酰苯并噻唑基)異惡唑-4-甲酰胺為先導(dǎo)化合物。逆向全合成方法以2,6-二氯苯甲醛為原料通過(guò)6步反應(yīng)，得到了9個(gè)目標(biāo)化合物。質(zhì)譜數(shù)據(jù)與高效液相色譜數(shù)據(jù)鑒定發(fā)現(xiàn)純度都達(dá)到99%以上，與核磁共振氫譜/碳譜（1H-NMR/13C-N

7、MR）數(shù)據(jù)均與目標(biāo)化合物一致。②體外檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增值抑制效應(yīng)為Cell Counting Kit-8法，運(yùn)用的細(xì)胞為Jurkat T淋巴細(xì)胞，將測(cè)試OD值轉(zhuǎn)化為可靠有效的活性數(shù)據(jù)，驗(yàn)證了雙鹵西林酰胺類衍生物對(duì)Jurkat T淋巴細(xì)胞的增值抑制作用。經(jīng)Western blotting方法檢測(cè)這類化合物的確可以抑制p-mTOR、以及下游蛋白4EBP1、P70S6K。③細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)給藥小鼠特異性的 CD8+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞比