三七三醇皂苷促腦梗死大鼠血管新生改善腦灌注機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:腦卒中是一種具有高發(fā)病率、死亡率、致殘率的常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中約87％是缺血性卒中。盡早恢復(fù)缺血區(qū)腦灌注，挽救缺血半暗帶瀕死神經(jīng)元是腦梗死治療的重心和目標(biāo)。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)促進(jìn)腦梗死后血管新生可減輕神經(jīng)功能缺損，縮小腦梗死體積。三七三醇皂苷(Panaxatriol Saponins，PTS)，是從中藥三七中提取的有效成份，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re為PTS的主要組成成分，前期多項(xiàng)研究證實(shí)PTS對(duì)腦梗死大鼠

2、具有保護(hù)作用，但具體機(jī)制不明。近期研究表明PTS三種主要成分均有促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，然而目前尚未有PTS在缺血腦損傷動(dòng)物體內(nèi)促血管新生方面的報(bào)道。
　　目的:(1)觀察PTS對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型的保護(hù)作用;(2)明確PTS促進(jìn)腦梗死后微血管新生改善腦灌注作用;(3)探討PTS促進(jìn)腦梗死后血管新生相關(guān)機(jī)制。
　　方法:取SPF級(jí)SD雄性大鼠，隨機(jī)分為(1)假手術(shù)組:腹腔注射生理鹽水，每日1次;(2) MCAO（大腦中

3、動(dòng)脈梗死）模型組:MCAO+等量生理鹽水，腹腔注射，每日1次;(3) PTS治療組:MCAO+PTS，腹腔注射PTS，50mg/kg/d。缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦組織TTC染色評(píng)價(jià)PTS對(duì)大鼠腦梗死的治療作用;采用Micro-PET影像技術(shù)評(píng)價(jià)PTS對(duì)腦血流灌注的影響;RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血管生長(zhǎng)相關(guān)因子基因及蛋白表達(dá)的變化;免疫熒光染色法評(píng)價(jià)腦梗死缺血半暗帶區(qū)微血管密度的改變;為

4、進(jìn)一步評(píng)價(jià)PTS促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，予MCAO大鼠Brdu腹腔注射，行Brdu與CD31免疫熒光共定位，評(píng)價(jià)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目;為深入探討PTS促血管新生機(jī)制，采取環(huán)靶明(Shh通路特異性阻斷劑)聯(lián)合PTS予MCAO大腹腔注射，Western blot技術(shù)評(píng)價(jià)Shh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及其對(duì)下游血管生長(zhǎng)因子的影響。
　　結(jié)果:(1) PTS對(duì)MCAO大鼠的腦保護(hù)作用: TTC及Neuron染色結(jié)果表明，PTS能夠明顯減小缺

5、血再灌注后3天、7天、14天時(shí)間點(diǎn)的大鼠腦梗死體積，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Longa神經(jīng)功能評(píng)分表明，PTS給藥3天開(kāi)始能夠改善MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，并持續(xù)到14天，與對(duì)照組比較P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2) PTS增加MCAO大鼠缺血側(cè)腦灌注:Micro-PET/CT掃描結(jié)果顯示，MCAO造模后1天18F-PDG腦攝取明顯減少，術(shù)后14天復(fù)查Micro-PET可見(jiàn)PTS治療組18F-PDG腦攝取量明顯增加，表明腦血流量明

6、顯改善，經(jīng)與對(duì)照組比較P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3) PTS增加缺血側(cè)皮層血管生長(zhǎng)相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平:RT-PCR結(jié)果表明，MCAO術(shù)后VEGF的mRNA水平隨時(shí)間延長(zhǎng)，呈持續(xù)增高樣趨勢(shì)，并且在第3天時(shí)間點(diǎn)PTS治療組與對(duì)照組之間產(chǎn)生差異(P＜0.05)，治療組優(yōu)于對(duì)照組，并且這種效果可以延續(xù)到14天;Ang-1的mRNA水平表達(dá)趨勢(shì)同VEGF; VEGFR2、Tie-2、CD31的mRNA表達(dá)水平在MCAO術(shù)后持續(xù)增高，并

7、且在第7天達(dá)到高峰，14天時(shí)有所下降，治療組與對(duì)照組從第3天開(kāi)始產(chǎn)生差異，治療組升高的幅度大于對(duì)照組(P＜0.05);α-SMA的mRNA水平在MCAO術(shù)后的表達(dá)的趨勢(shì)等同于Ang-1，同樣在第3天開(kāi)始，治療組與對(duì)照組間產(chǎn)生差異，治療組升高的幅度明顯大于對(duì)照組(P＜0.05)。(4) PTS上調(diào)缺血側(cè)大腦皮層VEGF、Ang-1及VEGR2、Tie-2蛋白表達(dá):western blot免疫印跡結(jié)果顯示，MCAO術(shù)后大鼠大腦皮層VEGF蛋

8、白水平在術(shù)后第7天達(dá)到高峰，第14天有下降趨勢(shì)，PTS與對(duì)照組比較在第3天，7天，14天時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Ang-1的蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸增加趨勢(shì)，且PTS與對(duì)照組比較在第3天，7天，14天時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在術(shù)后7天時(shí)間點(diǎn)，PTS治療組能夠明顯上調(diào)VEGFR2、Tie-2蛋白表達(dá)水平，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)。(5) PTS增加缺血側(cè)皮層微血管密度:研究結(jié)果表明缺血缺氧誘導(dǎo)病灶

9、周?chē)罅康难苄律?，而且微血管密度在腦梗死后7天達(dá)到高峰，14天時(shí)有所下降，PTS治療組在第7天和14天時(shí)間點(diǎn)CD31/α-SMA陽(yáng)性的微血管密度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。(6)PTS增加缺血側(cè)皮層血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖:CD31與Brdu免疫熒光共染顯示MCAO術(shù)后存在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖， PTS治療組CD31與Brdu共定位細(xì)胞明顯多于對(duì)照組，兩組比較P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(7) PTS激活Shh信號(hào)通路，上調(diào)血管生長(zhǎng)因子表達(dá):

10、術(shù)后7天western blot檢測(cè)Shh通路主要信號(hào)蛋白(Shh、Smo、Ptch-1)表達(dá)，結(jié)果顯示，術(shù)后PTS能夠明顯上調(diào)Shh、Smo、Ptch-1表達(dá)，環(huán)靶明靶向阻斷Shh信號(hào)后明顯減少PTS誘導(dǎo)的VEG及Ang-1表達(dá)，表明PTS可能主要通過(guò)激活Shh信號(hào)通路促進(jìn)腦梗死后血管新生。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明，腦梗死后PTS能夠通過(guò)激活Shh信號(hào)通路，上調(diào)缺血側(cè)腦組織VEGF/VEGFR2和Ang-1/Tie-2系統(tǒng)的表達(dá)