LINGO-1抗體對(duì)多發(fā)性硬化模型小鼠髓鞘和認(rèn)知功能的影響.pdf

1、本研究中，我們檢測(cè)了兩種常見的多發(fā)性硬化脫髓鞘模型小鼠（實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎模型小鼠和Cuprizone誘導(dǎo)的脫髓鞘模型小鼠）的行為學(xué)，并用western blot和免疫熒光技術(shù)等觀察了髓鞘蛋白和神經(jīng)元軸突結(jié)構(gòu)和功能蛋白表達(dá)水平以探討:1、脫髓鞘模型小鼠是否存在認(rèn)知功能障礙，以及小鼠認(rèn)知功能相關(guān)腦區(qū)是否存在髓鞘損傷;2、LINGO-1抗體能否改善脫髓鞘模型小鼠的認(rèn)知功能障礙及其病理?yè)p傷。最終，希望通過以上研究為多發(fā)性硬化認(rèn)知功能障礙的治

2、療提供新思路，為L(zhǎng)INGO-1抗體用于治療多發(fā)性硬化認(rèn)知功能障礙提供依據(jù)。
　　第一部分 實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎小鼠的改良與評(píng)價(jià)
　　目的:為了構(gòu)建能夠用于認(rèn)知功能行為學(xué)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)小鼠，對(duì)EAE造模藥物的劑量進(jìn)行了探索，并對(duì)改良的EAE模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　方法:采用不同劑量的髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG35-55)（200μg MOG35-55/只、100μg MOG35-55/只、50μg

3、 MOG35-55/只、25μg MOG35-55/只）、滅活結(jié)核分枝桿菌(H37RA)（800μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只、250μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只、100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只）和百日咳毒素（500 ng百日咳毒素/只、200 ng百日咳毒素/只）等藥物進(jìn)行EAE造模。造模后，按照神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:用開場(chǎng)試驗(yàn)檢測(cè)小鼠自發(fā)活動(dòng)能力。
　　結(jié)果:與高劑量藥物EAE造模組小鼠相比，低劑量藥物造模組小鼠（25μg

4、MOG35-55/只，100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只，200 ng百日咳毒素/只），在病程中，每天的平均神經(jīng)功能評(píng)分都明顯降低。低劑量藥物造模EAE組小鼠與陰性對(duì)照組相比，自發(fā)活動(dòng)速度無明顯差別[免疫后第16天，8.885±0.772 cm/s（EAE組），8.933±0.567 cm/s（陰性對(duì)照組）;免疫后第31天，11.130±0.630 cm/s（EAE組），10.670±0.959 cm/s（陰性對(duì)照組）;免疫后第55天，7.

5、686±0.428 cm/s（EAE組），8.313±0.918 cm/s（陰性對(duì)照組）](P＞0.05)。
　　結(jié)論:低劑量藥物（25μg MOG35-55/只，100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只，200 ng百日咳毒素/只）所造的EAE模型小鼠存在輕度的神經(jīng)功能障礙，但自發(fā)活動(dòng)功能無明顯損害。該模型可以用于研究多發(fā)性硬化認(rèn)知功能障礙的病理機(jī)制和藥物開發(fā)。
　　第二部分 實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎小鼠行為學(xué)和病理表現(xiàn)
　　目的

6、:探討實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)小鼠是否存在認(rèn)知功能障礙（空間學(xué)習(xí)記憶障礙）和焦慮、抑郁樣行為;探討EAE小鼠認(rèn)知功能相關(guān)的腦區(qū)是否存在脫髓鞘損傷。
　　方法:按照低劑量藥物（25μg MOG35-55/只，100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只，200 ng百日咳毒素/只）誘導(dǎo)EAE小鼠模型，分別在免疫后的早期（第13天）和免疫后的晚期（第55天）進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，包括糖水偏愛實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、曠野實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，每

7、只小鼠只完成其中一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的所有行為學(xué)檢測(cè)。行為學(xué)檢測(cè)完成之后，提取腦組織，進(jìn)行western blot檢測(cè)。
　　結(jié)果: EAE小鼠在其病程的早期和晚期，曠野實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和糖水偏愛實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)與陰性對(duì)照組相當(dāng)（P＞0.05）。水迷宮實(shí)驗(yàn)中，EAE小鼠在病程的早期，表現(xiàn)與陰性對(duì)照組小鼠相當(dāng)，不存在空間學(xué)習(xí)記憶障礙（P＞0.05）;但是，EAE小鼠在病程的晚期出現(xiàn)明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)期EAE小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間

8、長(zhǎng)于對(duì)照組小鼠，尤其是學(xué)習(xí)期第一天(P＜0.05)，檢測(cè)期EAE小鼠目標(biāo)象限運(yùn)動(dòng)路程百分比明顯低于對(duì)照組的小鼠（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示EAE小鼠的海馬旁回和穹窿-海馬傘出現(xiàn)明顯的脫髓鞘損傷，表現(xiàn)為髓鞘堿性蛋白(MBP)含量下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:EAE小鼠在病程的晚期出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙，這種空間學(xué)習(xí)記憶障礙可能與海馬旁回和穹窿-海馬傘髓鞘損傷有關(guān)。
　　第三部分 LINGO-1抗體促

9、進(jìn)髓鞘修復(fù)和EAE小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)
　　目的:探討LINGO-1抗體能否改善實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎模型(EAE)小鼠的認(rèn)知功能障礙（空間學(xué)習(xí)記憶障礙）及其病理?yè)p傷。
　　方法:按照低劑量藥物（25μg MOG35-55/只，100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只，200 ng百日咳毒素/只）誘導(dǎo)EAE小鼠模型;免疫后第14天開始系統(tǒng)的給予LINGO-1抗體治療，劑量為10 mg/kg，每6天一次腹腔給藥，給藥直至行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束

10、;免疫后第50天開始觀察陰性對(duì)照組、EAE模型組及EAE模型LINGO-I抗體治療組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和焦慮抑郁樣行為;行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，提取腦組織，用western blot和免疫熒光等方法檢測(cè)相應(yīng)腦區(qū)的髓鞘相關(guān)蛋白，軸突結(jié)構(gòu)和功能蛋白以及PI3K/AKT/m-TOR信號(hào)通路上蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:LINGO-1抗體干預(yù)后，三組小鼠在糖水偏愛實(shí)驗(yàn)、曠野實(shí)驗(yàn)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)沒有顯著差異(P＞0.05)。而Morris

11、水迷宮實(shí)驗(yàn)中，在學(xué)習(xí)期和檢測(cè)期EAE模型組小鼠的表現(xiàn)明顯差于陰性對(duì)照組小鼠，與陰性對(duì)照組小鼠相比，學(xué)習(xí)期EAE小鼠站臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，檢測(cè)期站臺(tái)周圍活動(dòng)路程明顯減少(P＜0.05);LINGO-1抗體治療組小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)的表現(xiàn)優(yōu)于EAE模型組，與EAE未治療組相比，學(xué)習(xí)期站臺(tái)潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，檢測(cè)期站臺(tái)周圍活動(dòng)路程有所增加，其活動(dòng)路程與陰性對(duì)照組相當(dāng)(P＞0.05)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EAE

12、小鼠的海馬旁回和穹窿-海馬傘出現(xiàn)明顯的脫髓鞘損傷，表現(xiàn)為髓鞘堿性蛋白(MBP)的含量下降(P＜0.05)，并伴有軸突順向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白驅(qū)動(dòng)蛋白輕鏈蛋白1(KLC1)含量的下降(P＜0.05)。給予具有重髓鞘功能的LINGO-1抗體干預(yù)后， EAE小鼠海馬旁回中的MBP和KLC1明顯升高（P＜0.05），而穹窿-海馬傘的MBP和KLC1無明顯提高(P＞0.05)。此外，LINGO-1抗體治療組小鼠海馬旁回PI3K/AKT/m-TOR信號(hào)通路活化

13、，表現(xiàn)為磷酸化的AKT和磷酸化的m-TOR較EAE未治療組表達(dá)增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:LINGO-1抗體可能通過修復(fù)髓鞘改善EAE小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙;LINGO-1抗體可能是通過活化PI3 K/AKT/m-TOR信號(hào)通路來介導(dǎo)這一過程的;LINGO-1抗體治療可能有助于脫髓鞘疾病患者認(rèn)知功能的恢復(fù)。
　　第四部分 LINGO-1抗體能夠改善Cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘模型小鼠的病理?yè)p傷
　　目的:探討Cu

14、prizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠行為學(xué)改變以及背側(cè)海馬區(qū)的病理?yè)p傷;探討LINGO-1抗體能否改善Cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠的行為學(xué)改變及其病理?yè)p傷
　　方法:用0.2％(w/w) cuprizone喂養(yǎng)C57BL/6小鼠誘導(dǎo)脫髓鞘模型，每天喂養(yǎng)直至行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束;在造模后第三周開始進(jìn)行LINGO-1抗體治療，劑量為10mg/kg，每6天一次腹腔給藥，給藥直至行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束;造模后第9周開始觀察正常對(duì)照組、cuprizone誘導(dǎo)

15、脫髓鞘模型組、cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘模型LINGO-I抗體治療組三組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和焦慮抑郁樣行為;行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，提取腦組織，采用western blot和免疫熒光等方法檢測(cè)背側(cè)海馬區(qū)的髓鞘相關(guān)蛋白、軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、軸突結(jié)構(gòu)蛋白、突觸相關(guān)蛋白、tau蛋白、和β淀粉樣蛋白等的表達(dá)。
　　結(jié)果:本研究發(fā)現(xiàn)Cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘模型小鼠存在輕度的空間學(xué)習(xí)能力障礙(P＜0.05)，伴有背側(cè)海馬髓鞘堿性蛋白(MBP)

16、含量下降（P＜0.05）。給予LINGO-1抗體干預(yù)后，Cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠記憶能力輕度提高，并伴有MBP含量增加(P＜0.05)。此外，在Cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠中，海馬區(qū)同時(shí)有軸突功能蛋白順向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白驅(qū)動(dòng)蛋白1(KLC1)、軸突結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白神經(jīng)絲蛋白輕鏈(NFL)和神經(jīng)絲蛋白重鏈(NF200)含量顯著下降（P＜0.05），LINGO-1抗體干預(yù)后，這些軸突功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的水平得以提高（P＜0.05）。然而在C