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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
本項(xiàng)目擬通過(guò)臨床、和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩方面的研究:
1)分析臨床不同類(lèi)型股骨頭壞死患者氧化應(yīng)激和凋亡的關(guān)系;篩查Nox/NADPH氧化酶在股骨頭壞死中的表達(dá);分析Nox/NADPH氧化酶在股骨頭壞死凋亡中可能的作用機(jī)制。
2)建立大鼠激素性股骨頭壞死模型,ROS抑制劑NAC和NADPH抑制劑DPI進(jìn)行激素性股骨頭壞死的治療。驗(yàn)證Nox-ROS-ASK1-p38/JNK通路在激素性股骨頭壞死中作用機(jī)制。
2、> 方法:
1.收集臨床標(biāo)本,其中病理組激素性股骨頭壞死患者8例,創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者8例,對(duì)照組股骨頸骨折患者8例。HE染色和TUNEL染色評(píng)估股骨頭壞死病理情況和細(xì)胞凋亡水平;8-OHdG和4-HNE免疫組織化學(xué)染色評(píng)估組織氧化應(yīng)激狀態(tài);RT-PCR和Western blot檢測(cè)篩查Nox/NADPH氧化酶在SIFHN中的表達(dá);驗(yàn)證ASK1-p38/JNK信號(hào)通路在SIFHN中的作用。分析氧化應(yīng)激在激素性股骨頭壞死和創(chuàng)傷
3、性股骨頭壞死作用機(jī)制的不同。
2.健康成年雄性Wistar大鼠共60只,隨機(jī)分成六組(每組10只)。A:空白對(duì)照組(Control);B:激素性股骨頭壞死組(Steroid);C:?jiǎn)渭?NAC組(NAC);D:激素性股骨頭壞死+NAC治療組(NAC+Steroid);E:?jiǎn)渭?DPI組(DPI);F:激素性股骨頭壞死+DPI治療組(DPI+Steroid);所有分組大鼠均按20μg/kg經(jīng)腹腔注射大腸桿菌內(nèi)毒素2次,每次間隔2
4、4h;最后一次注射大腸桿菌內(nèi)毒素24h后,B組、D組和F組大鼠按40mg/kg劑量經(jīng)左側(cè)臀肌注射甲基強(qiáng)的松,注射連續(xù)3次,每次間隔24h,連續(xù)3天;A組、C組和E組注射同等劑量的生理鹽水,連續(xù)三天;之后C組和D組,大鼠按150mg/kg/d腹腔注射N(xiāo)AC,直到6周;E組和F組大鼠按1mg/kg/d右側(cè)臀部皮下注射DPI,直到6周。6周末,處死動(dòng)物,一側(cè)股骨頭行顯微CT檢查后行HE染色和8-OHdG和4-HNE的免疫組織化學(xué)染色;另一側(cè)股
5、骨頭冠狀位切開(kāi)兩半之后,用于RT-PCR和Western blot檢查,篩查Nox1、Nox2、Nox4、ASK1、p38和JNK的表達(dá)。
結(jié)果:
1.臨床標(biāo)本收集后,HE染色發(fā)現(xiàn)激素性股骨頭壞死和創(chuàng)傷性股骨頭壞死有明顯區(qū)別。SIFHN主要病理特點(diǎn)是
1)脂肪樣變明顯,髓腔內(nèi)大量的脂肪細(xì)胞;
2)出現(xiàn)軟骨下骨的微骨折,囊性變較多;
3)新生骨較少。這些病理特點(diǎn)都是創(chuàng)傷性股骨頭壞死不具備的
6、特點(diǎn)。TUNEL染色,激素性股骨頭壞死組的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于創(chuàng)傷性股骨頭壞死組和對(duì)照組(P<0.001);免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)SIFHN氧化應(yīng)激8-OHdG染色和4-HNE染色的程度明顯高于創(chuàng)傷性股骨頭壞死和對(duì)照組(P<0.001)。
2.激素性股骨頭壞死的臨床患者RT-PCR和Western blot檢測(cè)高表達(dá)Nox4(P<0.001);此外激素組 ASK1-p38/JNK的表達(dá)明顯高于創(chuàng)傷組和對(duì)照組(P<0.001);激
7、素組呈現(xiàn)出對(duì)于NADPH氧化酶的高表達(dá),并高表達(dá)MAPK凋亡通路。
3.建立激素性股骨頭壞死模型,6周后激素性股骨頭壞死模型建立成功,空骨陷窩率明顯高于對(duì)照組(P<0.001);TUNEL染色發(fā)現(xiàn),DPI和NAC治療組細(xì)胞凋亡系數(shù)明顯低于激素組(P<0.001);免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),DPI和NAC治療組8-OHdG和4-HNE氧化應(yīng)激損傷程度明顯低于激素組(P<0.001);
4.分子生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn),NAC和DPI
8、治療組的ASK1,p38,JNK的mRNA表達(dá)和蛋白的表達(dá)明顯低于激素組(P<0.001);顯微CT顯示NAC和DPI治療組的骨小梁結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于激素組(P<0.001);
結(jié)論:
激素性股骨頭壞死患者股骨頭中細(xì)胞凋亡為主要的病理特點(diǎn),并伴有大量的氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)。Nox4可能是激素股骨頭壞死中氧化應(yīng)激的主要途徑。ASK1-p38/JNK信號(hào)途徑可能是氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要凋亡通路。大鼠激素性股骨頭壞死模型中通過(guò)R
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