腺病毒介導的HER2-siRNA聯(lián)合順鉑對人卵巢癌移植瘤的治療效應及SPECT顯像監(jiān)測研究.pdf

1、目的：構建針對Her2/neu的RNA干擾腺病毒載體包裝重組腺病毒，觀察重組腺病毒感染移植瘤并聯(lián)合化療藥物順鉑對人卵巢癌移植瘤的治療作用，并用131I-Herceptin作顯像劑，SPECT顯像活體監(jiān)測腺病毒介導的HER2-siRNA對移植瘤內HER2表達的干擾效應，為進一步研究卵巢癌的基因治療奠定實驗基礎。
　　方法：①根據(jù)本實驗室前期研究已經篩選出干擾效率滿意的HER-2/neu-shRNA序列，構建及鑒定特異性的HER2-s

2、iRNA腺病毒載體及一條隨機序列的陰性對照腺病毒載體。②將上述載體經Lipofectamine2000轉染到HEK293細胞中，采用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)進行腺病毒的包裝，并通過Adeno-X?Virus Purification Kit方法純化腺病毒，運用終點稀釋法測定腺病毒滴度。③卵巢癌SKOV-3細胞接種BALB/c裸鼠后隨機分組進行治療實驗：瘤內及瘤周注射特異性的HER2-siRNA腺病毒（Ad-HER2-RNAi組）、陰性腺

3、病毒（NC組）及PBS（CON組），檢測各組瘤體大小、瘤體重量、免疫組化測定各組HER2蛋白表達，利用131I-曲妥珠單克隆抗體（Herceptin）分別對荷卵巢癌移植瘤裸鼠進行SPECT放射免疫顯像，研究裸鼠間隔15天的兩次重復顯像、不同劑量的131I-Herceptin顯像變化及計算各實驗組腫瘤/本底（T/B）比值。④荷卵巢癌移植瘤裸鼠隨機分五組進行聯(lián)合治療實驗：特異性的HER2-siRNA腺病毒和順鉑（Ad-HER2-RNAi+D

4、DP組）、特異性的HER2-siRNA腺病毒和生理鹽水（Ad-HER2-RNAi組）、PBS和順鉑（DDP組）、陰性腺病毒和生理鹽水（NC組）、PBS和生理鹽水（CON組），每組的DDP和生理鹽水是腹腔注射給藥，其余為瘤內及瘤周注射。檢測各組裸鼠體重、瘤體大小、瘤體重量、免疫組化測定各組 HER2蛋白表達，利用131I-Herceptin對每組裸鼠進行SPECT放射免疫顯像，分析圖像變化，計算各組腫瘤/本底（T/B）比值。
　　結

5、果：①成功構建 HER2-siRNA干擾序列及隨機序列的腺病毒穿梭質粒，測序證實序列正確。②重組腺病毒成功包裝，獲得了高滴度1×1011 PFU/mL的腺病毒。③Ad-HER2-RNAi組移植瘤與CON組和NC組相比，平均瘤體積、瘤體重量均明顯減?。≒＜0.05）；免疫組化結果亦證實 Ad-HER2-RNAi組 HER2蛋白的表達明顯下調；各組裸鼠經尾靜脈注射131I-Herceptin后1h即可見移植瘤部位顯影，瘤體影像隨時間延長顯影

6、逐漸清晰，間隔15d裸鼠重復顯像無明顯差異，不同劑量顯像劑對圖像無明顯影像，因而后續(xù)實驗選擇中等劑量7.4MBq的131I-Herceptin作為每次顯像用量；比較各時間點T/B值及經組織厚度校正后的T/B值，Ad-HER2-RNAi組與CON組和NC組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。④聯(lián)合治療實驗結果顯示：與CON組和NC組比較，Ad-HER2-RNAi組和DDP組和Ad-HER2-RNAi+DDP組裸鼠移植瘤的平均瘤體積

7、和重量明顯下降（均P＜0.01），其中以后者更明顯。免疫組化結果顯示上述三組 HER2蛋白的表達均下調，聯(lián)合用藥組更明顯。SPECT顯像結果示三組治療組各時間點T/B原始比值及T/B校正值均低于CON組和NC組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。Ad-HER2-RNAi+DDP組各時間點T/B原始比值與Ad-HER2-RNAi組和DDP組相比，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。經校正后，除1h時間點外，其余各時間點聯(lián)合用藥組T/B校