AAV-2 P5啟動(dòng)子功能的分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、Rep介導(dǎo)的定點(diǎn)整合將AAV基因組插入人類(lèi)基因組19號(hào)染色體的AAVS1位點(diǎn),該機(jī)制用于基因治療研究可以實(shí)現(xiàn)目的基因安全長(zhǎng)期地表達(dá)。用Rep-AAVS1定點(diǎn)整合系統(tǒng)作基因轉(zhuǎn)移時(shí),為克服Rep蛋白的細(xì)胞毒性作用,維持Rep蛋白低水平瞬時(shí)表達(dá)是一個(gè)有待解決的問(wèn)題。驅(qū)動(dòng)Rep蛋白表達(dá)的AAV-2P5啟動(dòng)子是一個(gè)多功能的元件,可作為定點(diǎn)整合的底物以及反饋調(diào)控Rep的表達(dá)。P5-Rep表達(dá)框架反式提供Rep蛋白可以低水平表達(dá)Rep蛋白,但是由于P

2、5啟動(dòng)子本身是高效的定點(diǎn)整合底物,一方面和順式定點(diǎn)整合元件競(jìng)爭(zhēng)從而降低帶有目的基因的順式元件的整合效率,另一方面P5-Rep整合進(jìn)AAVS1位點(diǎn)會(huì)使得Rep長(zhǎng)期表達(dá)造成安全性隱患。本研究試圖通過(guò)突變分析來(lái)解析P5啟動(dòng)子定點(diǎn)整合和反饋調(diào)控的分子基礎(chǔ),嘗試尋找一種可以去掉定點(diǎn)整合功能而保留反饋調(diào)控活性的,具有應(yīng)用價(jià)值的P5啟動(dòng)子突變體。
　　在P5啟動(dòng)子內(nèi)核心區(qū)段TATA/RBE/Yyl進(jìn)行的突變分析顯示,P5 RBE對(duì)P5的定點(diǎn)整合

3、效率和有效的反饋調(diào)控能力都是必需的。雖然TATA box和Yyl+1位點(diǎn)的突變會(huì)造成P5啟動(dòng)子定點(diǎn)整合效率嚴(yán)重下降(分別只有8.3％和10.4％,野生型P5為34.0％以上),但是前者的突變只引起P5啟動(dòng)子反饋調(diào)控能力一定程度下降而后者的突變則幾乎不會(huì)影響P5啟動(dòng)子的反饋調(diào)控能力。對(duì)P5 RBE內(nèi)的核苷酸進(jìn)行了更加細(xì)致的突變分析發(fā)現(xiàn):P5 RBE中266GAGTGAGC273這一序列內(nèi)單個(gè)核苷酸的突變能造成P5啟動(dòng)子定點(diǎn)整合和反饋調(diào)控R

4、ep蛋白表達(dá)兩種功能的分化,其旁側(cè)序列對(duì)P5啟動(dòng)子的功能幾乎沒(méi)有影響。該序列內(nèi)的單核苷酸突變?cè)斐蒔5啟動(dòng)子定點(diǎn)整合能力的劇烈下降,但能保持有效的反饋效率,其中以C273T這一突變體的分化程度最高(6.5％的定點(diǎn)整合效率和76.0％的反饋調(diào)控效率)。體外Rep-P5RBE結(jié)合實(shí)驗(yàn)觀察到P5啟動(dòng)子的反饋調(diào)控能力主要依賴(lài)于Rep-P5RBE之間的親和力強(qiáng)弱,而其定點(diǎn)整合于AAVS1的能力不只是與Rep-P5RBE之間的親和力有關(guān),還存在其他的

5、因素。這些因素中,很可能包括P5RBE中266GAGTGAGC273這一序列本身的同源性。
　　上述P5啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)-功能上關(guān)系的研究結(jié)果提示P5啟動(dòng)子的定點(diǎn)整合和反饋調(diào)控Rep蛋白表達(dá)這兩種功能是可以分化的。并為Rep介導(dǎo)的定點(diǎn)整合機(jī)制及P5啟動(dòng)子的反饋調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步完善,提供了新的視角和觀點(diǎn)。而在基于Rep介導(dǎo)的定點(diǎn)整合基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中,用C273T這一P5啟動(dòng)子的突變體反式提供Rep蛋白是一個(gè)很好的選擇,它可以安全的提供瞬時(shí)、