金柑(Fortunella Swingle)乙醇提取物防治代謝綜合征及其主要酚類物質(zhì)抗癌活性的研究.pdf

1、金柑屬（Fortunella）植物屬于蕓香科（Rutaceae）柑橘亞科（Aurantioideae）柑橘族（Citreae）中的真正柑橘類植物，是柑橘屬植物的近緣屬植物，是著名的經(jīng)濟(jì)類果樹之一，也是我國特有的果樹資源。金柑果實(shí)果皮味甜，整果可以鮮食，同時可以廣泛用于制造果脯、果醬、果汁飲料等休閑食品，具有重要的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值。此外，金柑果實(shí)還具有特殊的藥用保健功效，古籍早有記載金柑具有止咳、化痰、防治感冒等功效，現(xiàn)代科學(xué)研究表明金柑含

2、有多種生物活性物質(zhì)，如類黃酮、檸檬苦素、多糖等，并被報道有抗氧化、抗炎等生物活性。心腦血管疾病和癌癥是威脅人類健康的重大疾病，篩選天然的生物活性物質(zhì)用于心血管疾病和癌癥的防治研究已經(jīng)成了食品、藥品等領(lǐng)域科學(xué)家共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。因此，金柑果品中生物活性物質(zhì)的種類和生物活性分析是目前柑橘類果品研究的重要方向，對保健食品，醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展具有重要作用。我國是金柑屬植物的起源中心，擁有所有金柑屬植物的生物類型。然而目前關(guān)于金柑屬植物的生物活性物

3、質(zhì)的檢測種類比較局限，檢測方法有待優(yōu)化，有關(guān)金柑果實(shí)提物防治代謝紊亂和抗癌功效的研究仍尚未見報道。因此，本研究系統(tǒng)分析了金柑果實(shí)醇提物中的化學(xué)成分，并探究其防治代謝綜合征的功效及作用機(jī)制同時初步評價金柑提取物主要成分的抗癌功效。
　　首先，本研究選取了四種我國主要栽培的金柑生物類型，分別是羅紋（Fortunella japonica Swingle，縮寫FJ）、大果羅?。‵ortunella margarita Swingle，縮

4、寫 FM）、蘭山金柑（Fortunella crassifolia Swingle，縮寫 FC_1）和瀏陽金彈（Fortunella crassifolia Swingle2，縮寫FC_2)。采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜（Ultra performance liquid chromatography-Q time of flight mass spectrometry，UPLC Q-TOF/MS）分析檢測金柑果實(shí)提取物中的化

5、學(xué)成分，并利用體外抗氧化活性方法評價金柑果實(shí)提取物抗氧化活性。其次，評價了FM對高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖C57BL/6小鼠代謝紊亂的防治作用。檢測FM對小鼠體重，攝食量，葡萄糖耐受量，胰島素抵抗，血清和肝臟中脂質(zhì)改善情況，同時利用實(shí)時熒光定量 PCR技術(shù)和報告基因技術(shù)對金柑果實(shí)提取物調(diào)節(jié)核受體過氧化物酶增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα）及其靶基因的作用進(jìn)行了探

6、討。最后，評價金柑主要生物活性物質(zhì)的抗癌功效。通過體外微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)篩選能影響tubulin聚合或解聚的金柑生物活性物質(zhì)，然后檢測該物質(zhì)對癌細(xì)胞存活率的影響。利用流式細(xì)胞技術(shù)觀察細(xì)胞周期，并用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞有絲分裂紡錘體形態(tài)，以及用免疫熒光蛋白技術(shù)檢測癌細(xì)胞中心體簇積情況。
　　本研究主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.金柑果實(shí)醇提物化學(xué)成分鑒定及抗氧化活性分析
　　1.1.金柑果實(shí)醇提取物成分鑒定
　　利用

7、UPLC Q-TOF/MS系統(tǒng)鑒定4種金柑果實(shí)乙醇提取物的化學(xué)成分。使用系統(tǒng)條件：（1）色譜條件。流動相A為0.01％甲酸，B為甲醇；梯度洗脫程序?yàn)椋?—0.6 min90%—80%A；0.6—5 min80%—30%A；5—7 min30%—10%A；7—8 min10%—90%A；流速：0.4 mL min-1；（2）質(zhì)譜條件。在正負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電壓為0.45 kV；錐孔電壓為40 V；離子源溫度為100℃；錐孔氣流速為50

8、L/h；脫溶劑氣溫度400℃；去離子氣流速600 L/h；低能為6V；高能為20V-40V；掃描范圍100 m/z到1000 m/z，數(shù)據(jù)響應(yīng)時間為0.2 s。
　　通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對信號的保留時間，質(zhì)荷比及質(zhì)譜碎片斷裂方式等信息初步鑒別出17種化學(xué)成分。3′,5′-di-C-glucopyranosylphloretin是金柑果實(shí)乙醇提取物中的最主要成分，也是特征性物質(zhì)。金柑果實(shí)醇提取物中的主要化合物為黃酮類化合物。四種不同生物類

9、型的金柑果實(shí)中含有的生物活性物質(zhì)種類基本相同，但是含量差別較大，F(xiàn)M中含有的主要黃酮類物質(zhì)含量最高。
　　1.2.金柑果實(shí)醇提取物體外抗氧化活性分析
　　通過DPPH法，F(xiàn)RAP法和ABTS法三種離線法測定4種金柑果實(shí)乙醇提取物的抗氧化活性。
　　DPPH和FRAP的結(jié)果都表明FM的抗氧化活性最高，其次是FJ，F(xiàn)C的抗氧化活性最低。然而 ABTS的結(jié)果卻顯示 FC的抗氧化活性最高，其次是 FM， FJ的抗氧化活性最低。

10、APC綜合評價指數(shù)表明FM的抗氧化活性最高。
　　2.金柑果實(shí)提取物防治代謝綜合征研究
　　2.1.預(yù)防實(shí)驗(yàn)
　　雌性C57BL/6小鼠被分別飼喂對照低脂飼料（Chow），高脂飼料（HF），高脂飼料添加1%w/w金柑果實(shí)提取物（HF+FME）共計8周。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ME能預(yù)防高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠肥胖。FME控制小鼠體重增加，減小肥胖小鼠白脂肪細(xì)胞大小。在HF+FME處理組中，F(xiàn)ME能夠抑制高脂膳食造成的小鼠空腹

11、血糖水平提高，改善葡萄糖耐受紊亂。此外，F(xiàn)ME降低血清中總膽固醇水平，低密度脂蛋白水平，以及肝臟總膽固醇水平。
　　2.2.治療實(shí)驗(yàn)
　　雌性C57BL/6小鼠先飼喂高脂飼料3個月，誘導(dǎo)成肥胖小鼠。肥胖小鼠隨機(jī)分配成兩組，一組繼續(xù)飼喂高脂飼料（HF），一組飼喂高脂飼料添加1% w/w金柑果實(shí)提取物（HF+FME）兩周。一直飼喂低脂飼料（Chow）小鼠作為對照。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ME抑制肥胖小鼠體重繼續(xù)增加，并降低肥胖小

12、鼠空腹血糖，改善肥胖小鼠葡萄糖耐受量和胰島素抵抗。此外，F(xiàn)ME降低肥胖小鼠血清總膽固醇，甘油三酯，血清低密度脂蛋白水平，小鼠肝臟中總膽固醇和甘油三酯水平。
　　2.3.分子機(jī)理研究
　　通過實(shí)時熒光定量PCR對小鼠肝臟中基因表達(dá)水平檢測，我們發(fā)現(xiàn)HF+FME組PPARα的轉(zhuǎn)錄水平顯著性高于HF組。此外，與HF組相比，HF+FME組PPARα下游靶標(biāo)如 cluster of differentiation36（CD36）， c

13、ytochrome P4504A10（CYP4A10），cytochrome P4504A14（CYP4A14）, acyl-CoA oxidase(ACO)和Stearoyl-CoA desaturase-1(SCD-1)的轉(zhuǎn)錄水平同樣顯著性增加。在HF+FME組中，小鼠褐脂肪Mitochondrial uncoupling proteins(UCP-2)的轉(zhuǎn)錄水平顯著性高于HF組小鼠。以上結(jié)果表明，F(xiàn)ME對小鼠糖脂代謝有可能是通過調(diào)

14、節(jié)PPARα的部分通路來實(shí)現(xiàn)的。然而，報告基因結(jié)果顯示高濃度（200mg/ml）金柑果實(shí)提取物，也不能激活PPARα的活性，添加激動劑后，金柑果實(shí)提取物對PPARα的活性也無影響。
　　3金柑主要生物活性物質(zhì)抗癌功效評價
　　3.1.微管蛋白體外聚合實(shí)驗(yàn)
　　利用微管蛋白體外聚合實(shí)驗(yàn)篩選對 tubulin蛋白動態(tài)聚合有影響的金柑主要生物活性物質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒食子酸（gallic acid,GA）能促進(jìn)微管蛋白的解聚，與空

15、白對照相比，GA處理能顯著減少微管的長度和數(shù)量，對微管成核有抑制作用。
　　3.2.GA抗癌功效研究
　　利用MTT，流式細(xì)胞技術(shù)，激光共聚焦顯微鏡，免疫熒光技術(shù)等研究了GA對癌細(xì)胞存活率，細(xì)胞周期，有絲分裂以及中心體簇積的影響。研究結(jié)果表明， GA呈時間和濃度依耐性抑制了癌細(xì)胞HeLa和HepG2的細(xì)胞存活率。GA影響了HeLa細(xì)胞細(xì)胞周期，使G2/M期細(xì)胞明顯增多。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)GA處理導(dǎo)致 HeLa細(xì)胞有絲分

16、裂紊亂加劇，紡錘體不規(guī)則排列，細(xì)胞分裂異常，同時會增加多核細(xì)胞比例。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GA影響了HeLa細(xì)胞多余中心體的正常簇積，這可能是導(dǎo)致細(xì)胞紡錘體不正常兩極化移動，細(xì)胞有絲分裂紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的原因。
　　綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出以下結(jié)論：金柑果實(shí)乙醇提取物中主要化合物為黃酮類化合物；在本研究4個金柑生物類型中，F(xiàn)M主要生物活性物質(zhì)含量最高，抗氧化活性最強(qiáng)；FM能防治高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠代謝綜合征；FM果實(shí)提