lncRNA CCAT1在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞惡性轉化中的作用及分子機制.pdf

1、肺癌作為惡性腫瘤之一，也是腫瘤相關死亡的首位死因，嚴重影響了人類健康和生活質量，且目前仍缺乏有效預防和治療手段。而吸煙則是人類肺癌發(fā)生發(fā)展的首要危險因素，已有許多流行病學研究證實吸煙者的肺癌患病率顯著高于非吸煙者的肺癌患病率。盡管香煙煙霧能夠增加肺部疾病的患病風險，但其誘導細胞惡性轉化引起肺癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制復雜且不易闡明。
　　最近有大量研究表明許多疾病的發(fā)生發(fā)展不僅與編碼蛋白的RNA有關，同時也與ncRNA的表達失調有關

2、。ncRNA中包括了最廣為人知的微小RNA(miRNA)以及最近被廣泛研究的長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)等。其中l(wèi)ncRNA是一類新興且目前研究較熱的大分子ncRNA，其長度超過200 nt，同時也可作為環(huán)境暴露的新的標志物，很有可能在驅動暴露疾病關聯(lián)中發(fā)揮重要作用。有研究表明lncRNA通過與miRNA相互作用參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展，但關于lncRNA與miRNA相互作用在環(huán)境有害因素，特別是吸煙所致疾病

3、的發(fā)病機制中的作用研究較少。
　　目的：
　　探討長鏈非編碼RNA CCAT1(CCAT1)通過miR-218和let-7c在香煙煙霧抽提物(CSE)慢性處理所致HBE細胞惡性轉化過程中的作用，從而揭示CSE所致HBE細胞惡性轉化的部分分子機制，為尋找吸煙所致肺損傷和肺癌的早期生物標志提供科學線索。
　　方法：
　　一、香煙煙霧抽提物對HBE細胞lncRNA與miRNA水平的影響
　　用20μg/mL CS

4、E急性處理HBE細胞0、6、12或24 h，或慢性處理HBE細胞0、20、30或40代后，用RT-PCR實驗方法檢測細胞CCAT1、MALAT1、HOTAIR和H19的水平;用qRT-PCR實驗方法檢測細胞CCAT1、miR-21、miR-125a、miR-218和let-7c的水平。以觀察CSE對HBE細胞lncRNA與miRNA水平的影響。
　　二、香煙煙霧抽提物對HBE細胞BMI1水平的影響
　　分別用0或20μg/m

5、L CSE急性處理HBE細胞0、6、12或24 h后，或慢性處理HBE細胞0、20、30或40代后，Western blot檢測細胞BMI1水平。以觀察CSE對HBE細胞BMI1水平的影響。
　　三、CCAT1調控miR-218水平對香煙煙霧抽提物所致HBE細胞BMI1水平升高的影響
　　分別將pGL3-CCAT1-WT/pGL3-Ctrl與miR-218 mimic/Con mimic共轉染處理HBE細胞后，或用用100

6、ppm CCAT1 siRNA或Con siRNA預轉染處理HBE細胞后，或用50 nM miR-218 mimic或Con mimic轉染預處理HBE細胞24 h后，再使用0或20μg/mL CSE處理HBE細胞24 h，用熒光素酶報告基因實驗方法檢測熒光素酶反應強度;qRT-PCR檢測細胞CCAT1水平和miR-218的水平;Western blot檢測HBE細胞BMI1的水平。分別用100 ppm CCAT1 siRNA/Cons

7、iRNA與miR-218 inhibitor/Con inhibitor共轉染處理HBE細胞24 h后，再分別用0或20μg/mL CSE處理HBE細胞24 h，利用Westem blot檢測HBE細胞BMI1水平。以觀察C CAT1調控miR-218水平對CSE所致HBE細胞BMI1水平的影響。
　　四、CCAT1通過miR-218調控BMI1在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞惡性轉化中的作用
　　分別用100 ppm CCA

8、T1 siRNA/Con siRNA與miR-218 inhibitor/Con inhibitor共轉染處理由CSE慢性處理所致惡性轉化HBE細胞(T-HBE)，或分別用50nMBMI1 siRNA或Con siRNA轉染處理T-HBE細胞，qRT-PCR檢測細胞miR-218的水平，Westem blot檢測細胞BMI1水平，軟瓊脂集落形成實驗觀察細胞惡性程度，Transwell實驗觀察細胞侵襲遷移能力。以觀察CCAT1通過miR-

9、218調控BMI1對CSE所致HBE細胞惡性轉化的影響。
　　五、香煙煙霧抽提物對HBE細胞c-Myc水平的影響
　　分別用0或20μg/mL CSE急性處理HBE細胞0、6、12和24 h，或慢性處理HBE細胞0、20、30和40代后，Western blot檢測細胞c-Myc水平。以觀察CSE對HBE細胞c-Myc水平的影響。
　　六、c-Myc在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞CCAT1水平升高中的作用
　　分

10、別用50 nM c-Myc siRNA或Con siRNA轉染HBE細胞后，分別用0或20μg/mL CSE處理HBE細胞24 h，或分別用0或20μg/mL CSE急性處理HBE細胞24 h后，Western blot檢測細胞c-Myc水平，qRT-PCR檢測細胞CCAT1水平;ChIP實驗方法檢測HBE細胞c-Myc與CCAT1啟動子區(qū)結合情況。以觀察c-Myc在CSE所致HBE細胞CCAT1水平升高中的作用。
　　七、let

11、-7c在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞c-Myc水平升高中的作用
　　將pmirGLO-c-Myc-3'UTR-WT/pmirGLO-Ctrl與let-7c mimic/Con mimic共轉染處理HBE細胞后，或用50 nM let-7c mimic或Con mimic轉染預處理HBE細胞24 h后，再使用0或20μg/mL CSE處理HBE細胞24 h，用熒光素酶報告基因實驗方法檢測細胞熒光素酶反應強度，qRT-PCR檢測細胞l

12、et-7c水平，Westernblot檢測細胞c-Myc水平。以觀察let-7c在CSE所致HBE細胞c-Myc水平升高中的作用。
　　八、CCAT1在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞c-Myc水平升高中的作用
　　用100 ppm CCAT1 siRNA或Con siRNA預轉染處理HBE細胞后，或分別將pGL3-CCAT1-WT/pGL3-Ctrl與let-7c mimic/Con mimic共轉染處理HBE細胞后，再聯(lián)合0

13、或20μg/mL CSE處理HBE細胞24 h;分別用100ppm CCAT1 siRNA/Con siRNA與let-7c inhibitor/Con inhibitor共轉染處理HBE細胞24 h后，再分別用0或20μg/mL CSE處理HBE細胞24 h，qRT-PCR檢測細胞CCAT1和let-7c水平，Western blot檢測HBE細胞c-Myc水平;熒光素酶報告基因實驗方法檢測熒光素酶反應強度。以觀察CCAT1在香煙煙霧

14、抽提物所致HBE細胞c-Myc水平升高中的作用。
　　九、CCAT1通過let-7c與c-Myc相互調控在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞惡性轉化中的作用
　　分別用100ppm CCAT1 siRNA/Con siRNA與let-7c inhibitor/Con inhibitor共轉染或分別用50 nM c-Myc siRNA或Con siRNA轉染處理T-HBE細胞，Westernblot檢測T-HBE細胞c-Myc水平;

15、軟瓊脂集落形成實驗觀察T-HBE細胞惡性程度;Transwell實驗觀察T-HBE細胞侵襲遷移能力。以觀察CCAT1通過let-7c與c-Myc相互調控對CSE所致HBE細胞惡性轉化的影響。
　　結果：
　　一、香煙煙霧抽提物對HBE細胞lncRNA與miRNA水平的影響
　　結果發(fā)現(xiàn)20μg/mL CSE急慢性處理引起HBE細胞CCAT1、MALAT1、HOTAIR、miR-21水平升高，let-7c和miR-218

16、水平下降，說明CSE引起HBE細胞CCAT1水平升高和miR-218和let-7c水平降低。
　　二、香煙煙霧抽提物對HBE細胞BMI1水平的影響
　　結果發(fā)現(xiàn)20μg/mL CSE急性處理6h或慢性處理20代后，HBE細胞BMI1水平顯著高于處理前或同代對照組HBE細胞，并有一定的時間-效應關系。說明CSE處理可以引起HEB細胞BMI1水平升高。
　　三、CCAT1調控miR-218水平對香煙煙霧抽提物所致HBE細胞

17、BMI1水平升高的影響
　　結果發(fā)現(xiàn)miR-218 mimic與pGL3-CCAT1-WT共轉染后聯(lián)合20μg/mL CSE處理組熒光素酶活性顯著低于單獨CSE處理組。通過siRNA下調CCAT1可阻滯CSE所致HBE細胞CCAT1和BMI1水平升高及miR-218水平降低;上調miR-218可阻滯CSE所致HBE細胞BMI1水平升高;與單獨下調CCAT1聯(lián)合CSE處理組相比，同時下調CCAT1和let-7c后聯(lián)合CSE處理HBE

18、細胞組的BMI1水平顯著回升。說明CCAT1可能通過調控miR-218的表達影響其下游BMI1的水平。
　　四、CCAT1通過miR-218調控BMI1在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞惡性轉化中的作用
　　結果發(fā)現(xiàn)，與單獨CSE處理HBE細胞組相比，通過siRNA下調CCAT1處理T-HBE細胞miR-218水平回升，同時BMI1水平下降，細胞集落形成數(shù)以及侵襲遷移細胞數(shù)顯著低于單純T-HBE細胞;而在下調CCAT1水平的基礎

19、上同時聯(lián)合下調miR-218處理T-HBE細胞后，BMI1水平顯著高于單獨下調CCAT1處理T-HBE細胞，細胞集落形成數(shù)和侵襲遷移細胞數(shù)顯著回升;下調BMI1后，T-HBE細胞的細胞集落形成數(shù)和侵襲遷移細胞數(shù)顯著下降。說明CCAT1通過miR-218調控BMI1影響了T-HBE細胞惡性程度和侵襲轉移能力。
　　五、香煙煙霧抽提物對HBE細胞c-Myc水平的影響
　　結果發(fā)現(xiàn)20μg/mL CSE急性處理6h或慢性處理20代

20、后，HBE細胞c-Myc水平顯著高于處理前或同代對照HBE細胞，并具有一定的時間．效應關系。說明CSE處理引起HEB細胞c-Myc水平升高。
　　六、c-Myc在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞CCAT1水平升高中的作用
　　結果發(fā)現(xiàn)20 gg/mL CSE處理組c-Myc和CCAT1水平顯著高于對照HBE細胞，通過siRNA關閉c-Myc可阻滯20μg/mL CSE所致HBE細胞c-Myc和C CAT1水平升高;20μg/mL

21、 CSE急性處理HBE細胞后c-Myc與CCAT1啟動子區(qū)結合增加。說明c-Myc在CSE所致HBE細胞CCAT1水平升高中具有重要作用。
　　七、let-7c在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞c-Myc水平升高中的作用
　　結果發(fā)現(xiàn)上調let-7c可阻滯20μg/mL CSE所致HBE細胞c-Myc水平升高;let-7c mimic與pmirGLO-c-Myc-3'UTR-WT共轉染后聯(lián)合20μg/mL CSE處理組熒光素酶活

22、性顯著低于單獨CSE處理組。說明let-7c通過與c-Myc的3'-UTR區(qū)結合抑制CSE處理HBE細胞c-Myc的表達。
　　八、CCAT1在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞c-Myc水平升高中的作用
　　結果顯示通過siRNA下調CCAT1可顯著阻滯20μg/mL CSE所致HBE細胞CCAT1和c-Myc水平升高;let-7c mimic與pGL3-CCAT1-WT共轉染后聯(lián)合20μg/mL CSE處理組熒光素酶活性顯著低

23、于單獨CSE處理組;CCAT1 siRNA和let-7c inhibitor聯(lián)合CSE處理組的c-Myc水平顯著高于單獨CCAT1 siRNA聯(lián)合CSE處理組，同時let-7c水平顯著下降。說明CCAT1可能通過與let-7c結合從而引起其下游c-Myc的水平變化。
　　九、CCAT1通過let-7c與c-Myc相互調控在香煙煙霧抽提物所致HBE細胞惡性轉化中的作用
　　結果發(fā)現(xiàn)，通過siRNA下調CCAT1可使T-HBE細

24、胞c-Myc水平、細胞集落形成數(shù)和侵襲遷移細胞數(shù)顯著下降;而在利用siRNA下調CCAT1水平的基礎上聯(lián)合let-7c inhibitor處理T-HBE細胞后，c-Myc水平、細胞集落形成數(shù)和侵襲遷移數(shù)顯著高于單獨CCAT1 siRNA處理T-HBE細胞組。說明CCAT1可能通過let-7c調控c-Myc影響了T-HBE細胞的惡性程度和侵襲轉移能力。
　　結論：
　　1、CSE引起HBE細胞CCAT1水平升高及miR-218