棉酚對人食管癌細胞系SEG-1細胞體外增殖抑制作用和機制及其在裸鼠模型體內(nèi)作用的實驗研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 棉酚對人食管癌SEG-1細胞體外增殖抑制作用及其機制研究
　　目的與方法：
　　1.本實驗采用臺盼藍染色法觀察棉酚對食管癌細胞系SEG-1細胞的抗增殖作用。
　　2.本實驗采用Wright-Giemsa染色、Hoechst33258熒光顯微鏡、透射電鏡檢查棉酚作用的食管癌細胞形態(tài)學(xué)、瓊脂糖凝膠電泳分析棉酚作用食管癌細胞后DNA有無梯狀帶型、流式細胞檢查細胞中DNA含量定量

2、分析細胞凋亡情況等方法來了解棉酚對食管癌細胞系SEG-1細胞的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　3.通過測定caspase-9、caspase-3活性及流式細胞儀分析Bcl-2、Bcl-xL在棉酚作用前后的表達變化，探討棉酚對食管癌細胞系SEG-1細胞的作用機制。
　　4.本實驗采用流式細胞儀分析食管癌細胞系SEG-1細胞的細胞周期在棉酚干預(yù)前后的變化，探討棉酚對SEG-1細胞細胞周期的影響。
　　結(jié)果：
　　醋酸棉酚、單醛棉

3、酚不同濃度對SEG-1細胞生長均存在不同程度的抑制作用，且與藥物濃度及作用時間密切相關(guān)。1μM醋酸棉酚對SEG-1細胞生長抑制作用較弱。醋酸棉酚、單醛棉酚濃度達到10μM時，SEG-1細胞生長被完全抑制，在培養(yǎng)72 h時，細胞呈負生長狀態(tài)。當濃度低于10μM時，相同濃度下，單醛棉酚對SEG-1細胞生長抑制作用明顯強于醋酸棉酚(P＜0.05);當濃度高于10μM時，相同濃度下，單醛棉酚對SEG-1細胞生長抑制作用弱于醋酸棉酚(P＜0.05

4、)。單醛棉酚在SEG-1細胞培養(yǎng)24h、48h、72h時的IC50值均低于醋酸棉酚(P＜0.05)。
　　Wright-Giemsa染色普通光鏡觀察到SEG-1細胞經(jīng)0.1％DMSO處理后細胞，呈多變形，邊緣清晰，形態(tài)和狀態(tài)良好，細胞間排列緊密，規(guī)整有序，貼壁生長，有個別凋亡細胞。隨著棉酚劑量的增加，細胞形態(tài)改變明顯，細胞間隙逐漸增大，細胞數(shù)逐漸減少;胞體回縮變圓，胞漿內(nèi)空泡、漂浮樣改變細胞增多。
　　Hoechst3325

5、8熒光顯微鏡可見正常細胞核呈彌散均勻的微弱藍色熒光。而經(jīng)單醛棉酚處理12h，細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)有濃染致密的顆粒狀強藍色熒光，細胞質(zhì)中并有凋亡小體散在分布。
　　透射電鏡觀察到正常細胞線粒體較多，形態(tài)正常，核染色質(zhì)呈絮點狀，均勻分散;經(jīng)25μM單醛棉酚處理12h后，多數(shù)線粒體腫脹變圓，嵴結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，細胞核染色質(zhì)凝集、部分成塊;經(jīng)25μ M單醛棉酚處理24h后，大部分線粒體呈空泡狀，嵴結(jié)構(gòu)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)均消失，細胞核變形，塊狀染

6、色質(zhì)向核膜靠攏。
　　瓊漿電泳分析可觀察到:DMSO處理組未出現(xiàn)DNA梯狀帶，DNA集中在加樣孔附近，未出現(xiàn)彌散，是基因組DNA的表現(xiàn)。而經(jīng)棉酚處理后出現(xiàn)梯狀條帶，說明棉酚能導(dǎo)致食管癌細胞DNA的片段化，能誘導(dǎo)食管癌細胞凋亡。
　　細胞內(nèi)DNA含量測定:在5μM、10μM、25μM醋酸棉酚和單醛棉酚處理24 h、48h時測定二倍體細胞比例，結(jié)果顯示醋酸棉酚和單醛棉酚，隨著濃度的增加，細胞的凋亡率逐漸升高(P＜0.05)，而單

7、醛棉酚在相同濃度相同處理時間情況下的細胞凋亡率明顯高于醋酸棉酚(P＜0.05)。
　　細胞凋亡的酶學(xué)分析:兩種棉酚均可引起SEG-1細胞內(nèi)caspase-9、caspase-3活性升高，在處理后6h內(nèi)活性升高顯著，隨后逐漸降低。醋酸棉酚處理后6hcaspase-9活性顯著高于單醛棉酚，而在處理后18h、24h明顯低于單醛棉酚，說明醋酸棉酚在處理后早期caspase-9活性升高快，但6h后降得也快，而單醛棉酚處理6h后caspase

8、-9活性下降較慢;caspase-3活性在處理后12h內(nèi)活性升高顯著，隨后逐漸降低。醋酸棉酚處理后6h、12h時caspase-3活性顯著高于單醛棉酚，而在處理后18 h、24 h明顯低于單醛棉酚。
　　Bcl-2家族蛋白分析:醋酸棉酚和單醛棉酚處理后Bcl-2、Bcl-xL表達水平明顯降低，以DMSO處理的Bcl-2、Bcl-xL表達量設(shè)定為100％，醋酸棉酚處理組Bcl-2表達量下降69.4％，單醛棉酚處理組Bcl-2表達量下

9、降70.8％;醋酸棉酚處理組Bcl-xL表達量下降54.0％，單醛棉酚處理組Bcl-xL表達量下降39.5％。
　　細胞周期分析:應(yīng)用不同濃度的醋酸棉酚或單醛棉酚處理SEG-1細胞24h后，細胞周期變化較小，但當處理時間延長至48h后，SEG-1細胞有不同程度的G1期細胞增多，S期細胞減少，對G2期影響較小，提示醋酸棉酚能使食管癌細胞停滯在G1期，細胞進入增殖期減少，DNA合成速度減慢。醋酸棉酚25μM處理48h后因亞二倍體或碎片

10、細胞增多，影響周期分析，因此未對該濃度處理的細胞進行分析。而單醛棉酚則使食管癌細胞G2期細胞的增多，G1期細胞減少，S期細胞無明顯影響，提示單醛棉酚主要使食管癌細胞停滯在G2期，抑制其增殖。單醛棉酚25μM處理48h的細胞周期分布與DMSO對照組比較無明顯差異
　　結(jié)論：
　　1.帛酚可有效抑制食管癌細胞系SEG-1細胞的增殖，且存劑量-時間效應(yīng)。而單醛棉酚的作用強于醋酸棉酚。
　　2.棉酚可誘導(dǎo)食管癌細胞系SEG-1

11、細胞的凋亡，且存劑量-時間效應(yīng)，單醛棉酚的誘導(dǎo)凋亡作用強于醋酸棉酚。這種作用可能與caspase-9、caspase-3的激活及Bcl-2、Bcl-xL表達降低相關(guān)。
　　3.棉酚對食管癌細胞系SEG-1細胞的細胞周期產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，醋酸棉酚、單醛棉酚可分別使細胞阻滯在G1期、G2期。
　　第二部分 棉酚對食管癌細胞系SEG-1細胞裸鼠模型體內(nèi)作用的研究
　　目的與方法：
　　探討棉酚在食管癌細胞系SEG-1細胞裸

12、鼠模型體內(nèi)的作用。取健康SPF級BALb/c雌性裸鼠30只，分為6組，即醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組和單醛棉酚60mg/kg組、空白對照組、陰性對照組，每組5只，空白組未接種及棉酚處理，其余5組均接種SEG-1細胞，醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組和單醛棉酚60mg/kg組分別在接種腫瘤后第3天給予相應(yīng)劑量棉酚處理，觀察各組腫瘤體積和重量的變化，

13、計算腫瘤生長抑制率和腫瘤生長延遲時間，觀察裸鼠接種后體重變化，解剖測量肝、脾重量的變化。
　　結(jié)果：
　　一般情況:裸鼠在接種前生活狀態(tài)始終正常、食欲旺盛、行動自如。皮下接種SEG-1細胞1×107個細胞后第1天即出現(xiàn)精神萎靡、飲食不振、體毛聳立等癥狀，繼而行動遲緩直至死亡。裸鼠在接種細胞第4天時皮下出現(xiàn)肉眼可見的明顯腫塊，腫塊逐漸增大，裸鼠存活時間為(13.0±1.0)天。死亡后解剖發(fā)現(xiàn)腫瘤灶與周圍組織粘連，部分裸鼠腹腔有

14、腹水，肝脾腫大。腫塊解剖后制作成細胞懸液，染色后于顯微鏡下觀察腫瘤細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與SEG-1細胞一致。
　　病理檢查:醋酸棉酚40 mg/kg組代表給藥組腫瘤與陰性對照組裸鼠的腫瘤標本進行病理對照。給藥組腫瘤大小及浸潤范圍均小于陰性對照組，腫瘤分化稍好于陰性對照組，腫瘤血管形成較陰性對照組差。
　　腫瘤生長變化:各給藥組裸鼠皮下腫塊均出現(xiàn)不同程度的縮小、腫塊生長速度減慢。腫瘤生長抑制率:醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60m

15、g/kg組、單醛棉酚40mg/kg組、單醛棉酚60mg/kg組分別為14.3％、31.2％、33.7％、32.9％(P＜0.05)，醋酸棉酚40mg/kg組腫瘤生長延遲天數(shù)比醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組、單醛棉酚60mg/kg組少1天。陰性對照組裸鼠接種SEG-1細胞后13天后體重顯著超過未接種SEG-1細胞的裸鼠。醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組裸鼠經(jīng)腹腔注射醋酸棉酚后第1天開始出現(xiàn)活動減少，逐

16、漸消瘦，醋酸棉酚60mg/kg組裸鼠體重在用藥第5天開始顯著低于陰性對照組，醋酸棉酚40mg/kg組裸鼠體重在用藥第6天開始顯著低于陰性對照組。單醛棉酚40mg/kg組、單醛棉酚60mg/kg組裸鼠經(jīng)腹腔注射醋酸棉酚后體重變化與陰性對照組基本一致。
　　棉酚對裸鼠肝、脾重量及生存期的影響:在接種腫瘤后第10天、死亡時解剖裸鼠發(fā)現(xiàn)，未接受棉酚干預(yù)的陰性對照組裸鼠肝臟較正常裸鼠肝臟明顯增重，說明SEG-1腫瘤細胞已經(jīng)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移;給予4

17、0mg/kg醋酸棉酚干預(yù)的接種裸鼠肝臟重量明顯低于陰性對照組，而給予40mg/kg或60mg/kg甲醛棉酚干預(yù)的裸鼠肝臟較對照組并沒有減輕。醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組裸鼠生存時間明顯短于陰性對照組。醋酸棉酚雖有良好的抗腫瘤作用，但同時也使裸鼠生存時間縮短，說明醋酸棉酚毒性作用比單醛棉酚大。而單醛棉酚在確保較強的抗腫瘤作用的同時，無明顯的毒副作用，可延長裸鼠的生存期。
　　結(jié)論：
　　1.醋酸棉酚、單醛