大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞Thy-1+Lin-亞群在體外誘導向肝細胞分化過程中OCT4啟動子甲基化變化.pdf

1、我國是乙肝大國，乙肝病毒攜帶者已達12000萬人，而乙肝患者已達3000萬，相當數(shù)量的慢性肝炎病人反復發(fā)病，久治不愈，干細胞移植治療終末期肝病能有效逆轉(zhuǎn)肝功能，并已在小范圍的臨床試驗中取得一定成效，有望為廣大等待移植的患者提供過渡的橋梁，甚至達到徹底治愈的目的，同時能避免異體排斥反應(yīng)、倫理等問題，為終末期肝病的治療提供了新思路。
　　目前對骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為各種成體細胞已有多種方案，本實驗組已篩選出適合分化為肝細胞的表型的

2、骨髓間充質(zhì)干細胞。在干細胞的縱向分化中，其調(diào)控機制十分復雜，受多種調(diào)控因子形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)。多能性基因OCT4處于干細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂點，決定著干細胞增殖和分化的命運，與多種靶基因共同參與到LIF、Wnt及Tgf-β等多種重要調(diào)節(jié)通路。目前大量實驗表明，表觀遺傳學修飾與干細胞的增殖分化、腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，其修飾方式包括DNA及組蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等。雖然在大量的動物實驗及小范圍的臨床試驗中，干細胞移植已取得十分顯著

3、的成果，但也有研究表明，干細胞在分化中也存在致瘤性的問題。因此有必要對骨髓間充質(zhì)干細胞的分化調(diào)控機制作更深入的研究。
　　目的：目前關(guān)于干細胞的縱向分化及橫向分化的調(diào)控機理仍不甚明確，DNA甲基化作為最常見的表觀遺傳修飾方式，本文從這方面探究了OCT4啟動子在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞Thy-1+Lin-亞群分化過程中的甲基化變化。采用焦磷酸序測法檢測OCT4啟動子每個CpG位點的甲基化頻率，從而進一步揭開骨髓間充質(zhì)干細胞的表觀遺傳調(diào)控

4、機制，為日后干細胞移植更安全應(yīng)用于臨床上提供更多的理論支持。
　　方法：Thy-1+Lin-RBMMSCs的培養(yǎng)及誘導；Thy-1+Lin-RBMMSCs分化過程中相關(guān)基因mRNA的檢測；按照RNA提取試劑盒（美國Omega公司）說明書從每瓶約1×107個細胞中提取RNA，經(jīng)ND-1000分光光度計檢測吸光度均大于1.9，保存于-80℃?zhèn)溆?。；cDNA第一鏈合成，引物由上海生工公司設(shè)計并合成。ALB引物:上游5'-TACACCCA

5、GAAAGCACCTCA-3'，下游5'-TACACCCAGAAAGCACCTCA-3';OCT4引物:上游5'-GGACACCTGGCTTCAGACTT-3'，下游5'-TCCCTCCACAGAACTCGTATG-3';GADPH引物:上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。冰上融化各試劑后，按說明書配制20μl反應(yīng)體系，放入ABI7900 PCR儀（美

6、國ABI公司）后按25℃10 min、50℃60min設(shè)置反應(yīng)參數(shù)，之后85℃加熱5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，馬上冰浴，-20℃長期保存?zhèn)溆谩崟r熒光定量PCR(Quantitative real time PCR, qRT-PCR)反應(yīng)
　　冰上融化試劑后，按說明書配制反應(yīng)50μl體系，之后用封板膜封閉96孔板，1500×g離心2min;將板放入Roche LightCycler480 PCR儀（瑞士Roche公司）中，按95℃變性1

7、0s，60℃退火20s，72℃延伸20 s，經(jīng)45個循環(huán)擴增反應(yīng)。用相對定量法計算PCR結(jié)果。
　　選取OCT4轉(zhuǎn)錄起始位點上游+1至-364bp間的主要啟動子區(qū)域，含4個CpG位點，其中第4個CpG位點即為GC盒。引物由PyroMark Assay Design2.0軟件設(shè)計。因各CpG位點相距較遠，分成三個測序段以保證測序的準確性。第一段引物:正向5'-TGGAGAAGTGAAAGAGATAGAGT-3'，反向5'-CCAAT

8、CCCACCCTCTAACCTTAA-3'，測序5'-GAA GGTTTA TTTGGTTG T-3';第二段引物:正向5'-GAGGAATGTGGAGAAGTGAAAGAGATAG-3'，反向5'-GAGGAATGTGGAGAAGTGAAAGAGATAG-3'，測序5'-AGTTTTTTAGATTTTAGGTAAATT-3';第三段引物:正向5'-TGGAGAAGTGAAAGAGATAGAGT-3'，反向5'-CCAATCCCACCC

9、TCTAACCTTAA-3'，測序
　　5'-CTTAACCTCTAACCCC-3'。根據(jù)說明書配制50μl反應(yīng)體系，置入ABI9700 PCR儀進行反應(yīng)。參數(shù)設(shè)置為:95℃預(yù)熱3min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，經(jīng)40個循環(huán)擴增反應(yīng)，72℃冷卻7min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物品質(zhì)。在96孔PCR反應(yīng)板中按說明加入反應(yīng)結(jié)合珠2μl，后將探頭上結(jié)合珠及PCR產(chǎn)物置入40μl退火緩沖液（含測序引物1

10、.5μl），85℃變性2min，冷卻至室溫，使引物與范本退火雜交。在試劑艙中依次加入底物混合物、酶混合物及四種dNTP(深圳華大基因公司)，將試劑艙及96孔反應(yīng)板放入焦磷酸測序儀(PyroMark Q96 ID，德國Qiagen公司)進行反應(yīng)，Pyro Q-CpG軟件自動分析每個CpG位點甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果：
　　3.Thy-1+Lin-RBMMSCs的分化形態(tài)
　　復蘇后的Thy-1+Lin-RBMMSCs細胞分

11、布均勻，形態(tài)透明均一，呈橢圓形。約24h后基本貼壁生長，呈長梭形，集落呈漩渦狀;剛加入25ng/ml重組人肝細胞生長因子及0.1nmol/L地塞米松時細胞無明顯變化;誘導至7d時細胞多呈長梭形、多邊形生長，漩渦狀消失;誘導至14d時細胞進一進變圓，胞內(nèi)細胞器增多。
　　3.Thy-1+Lin-RBMMSCs分化過程中OCT4及ALB mRNA的表達
　　更換為誘導培養(yǎng)基后，0d組的ALB和OCT4 mRNA表達與未分化組相比

12、無明顯變化。誘導至7d，ALB mRNA與未分化組相比增加了5.22倍(P=0.025)，而OCT4 mRNA表達則下調(diào)至0.23倍(P=0.003);誘導至14d，ALB mRNA與未分化組相比增加了14.7倍(P=0.000)，OCT4 mRNA表達則進一步下調(diào)至0.055倍(P=0.000)。
　　3.OCT4啟動子甲基化分析
　　對Thy-1+LinRBMMSCs誘導分化為肝細胞過程中OCT4啟動子進行了甲基化焦磷酸

13、測序。在OCT4核心啟動子區(qū)的焦磷酸測序圖中，可見測序峰清晰，干擾背景小，序列結(jié)果與GeneBank收錄的一致，預(yù)測的4個CpG位點中，上游3個CpG位點均顯示出不同程度的甲基化。設(shè)定20％為區(qū)分高甲基化和低甲基化界限，高于該值為高甲基化，低于該值為低甲基化。其中7d組CpG1-2-3甲基化頻率高于0d組及未分化組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);14d組CpG1-2-3甲基化頻率高于7d組、0d組及未分化組，差異有統(tǒng)計學意義(P=

14、0.000);而CpG4在各組中差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，即GC盒在誘導分化程中均無明顯甲基化。
　　結(jié)論：
　　1.在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞Thy-1+Lin-亞群分化為肝細胞的過程中，OCT4mRNA表達持續(xù)降低，但其啟動子甲基化頻率持續(xù)升高，表明OCT4 mRNA的表達可能受其啟動子甲基化調(diào)控，其啟動子高甲基化抑制mRNA的表達，可能參與干細胞分化調(diào)控的環(huán)節(jié)。
　　2.第4個CpG位點，即GC盒在大鼠骨髓