SIRT1通過增強(qiáng)PGC-1α介導(dǎo)的線粒體發(fā)生而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　在明確SIRT1在肝癌中的表達(dá)模式及與臨床預(yù)后的相關(guān)性的基礎(chǔ)上，揭露SIRT1通過促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移而影響肝癌的預(yù)后，通過發(fā)現(xiàn)SIRT1與PGC-1α的相互作用，闡明了SIRT1通過促進(jìn)PGC-1α介導(dǎo)的線粒體發(fā)生而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。
　　方法：
　　(1)收集第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院肝膽外科不同分期的原發(fā)性肝癌患者術(shù)中的肝癌組織及相鄰非腫瘤組織共72例，同時(shí)收集5例無肝病的正常肝組織，術(shù)中收集的組織部分

2、立即凍存于-80℃中，用于提取蛋白及RNA，另一部分組織用4％多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，切片成5μm用于免疫組織化學(xué)染色。Western blot用于檢測(cè)SIRT1在肝癌組織及肝癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)水平，Real Time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIRT1在肝癌樣本中的mRNA表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)檢測(cè)SIRT1在肝癌組織中的表達(dá)部位及強(qiáng)度。
　　(2)采用慢病毒轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選的方式構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞株。CCK-8試劑盒用于檢測(cè)細(xì)

3、胞的活力，Cell-LightTM EdU Apollo567試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖，通過皮下移植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIRT1對(duì)肝癌的成瘤性的影響。
　　(3)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT標(biāo)志物CK-18，vimentin，fibronectin在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。NAO染色和MitoTracker(@) Red CM-H2XRos探針染色實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)肝癌細(xì)胞中敲除SIRT1對(duì)線粒體質(zhì)量的影響。通過構(gòu)建肝臟原位移植模型檢測(cè)肝癌細(xì)胞中敲除SIRT

4、1和過表達(dá)PGC-1α對(duì)裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響?；铙w動(dòng)物成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝癌形成轉(zhuǎn)移灶的部位和時(shí)間。
　　(4)統(tǒng)計(jì)分析方法:定量比較SIRT1的蛋白表達(dá)及mRNA水平在肝癌組織及相鄰非腫瘤組織中的差別采用配對(duì)t檢驗(yàn)。SIRT1的相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的比較，根據(jù)分組的不同采用非參秩和檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)分析。而患者無病生存期和綜合生存率分別指從肝癌切除術(shù)當(dāng)天開始到患者第一次復(fù)發(fā)或者死亡的時(shí)間，采用Kaplan-Mei

5、er's分析評(píng)估SIRT1的相對(duì)表達(dá)量與患者無病生存期和綜合生存率的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)中兩組間的數(shù)據(jù)采用Student's t檢驗(yàn)，而多組間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，而統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，雙側(cè)檢驗(yàn)P值小于0.05定義為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　(1)SIRT1在肝癌細(xì)胞株中呈普遍的高表達(dá)相對(duì)于永生型肝細(xì)胞株L02，SIRT1在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平較相鄰的非腫瘤組織明顯增

6、高(n=24，P=0.005)，而SIRT1在肝癌組織中呈普遍高表達(dá)模式，過表達(dá)率為56.9％(41/72)，而其蛋白表達(dá)水平在肝癌組織中較相鄰非腫瘤組織明顯增高(n=72，P=0.012)。免疫組化顯示SIRT1在肝癌組織中的表達(dá)水平較相鄰非腫瘤組織及正常肝組織均明顯增高，且在肝癌組織中主要位于細(xì)胞核。臨床參數(shù)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)增高的SIRT1表達(dá)水平與門靜脈癌栓形成(P=0.0039)，肝癌晚期的TNM分期(P=0.0016)密切相關(guān)，而

7、與其他病理參數(shù)無明顯相關(guān)性，如年齡，性別，HBV感染，Child-Pugh肝功能分級(jí)，肝硬化程度，血清AFP水平，腫瘤大小，Edmondson-Steiner病理分級(jí)，Milan標(biāo)準(zhǔn)。Kaplan-Meier's分析發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達(dá)的患者較SIRT1低表達(dá)的患者有更短的無病生存期(P=0.021)和更差的綜合生存率(P=0.039)，以上結(jié)果表明SIRT1的表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的有效指標(biāo)。
　　(2)肝癌細(xì)胞株中過

8、表達(dá)或者敲除SIRT1不影響細(xì)胞的活力或者增殖，而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示在肝癌細(xì)胞MHCC97H中SIRT1敲除組與對(duì)照組顯示出相似的腫瘤細(xì)胞增殖曲線，且腫瘤體積和重量在兩組間無明顯差異。以上結(jié)果表明SIRT1的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和成瘤性無明顯影響。肝癌細(xì)胞MHCC97中創(chuàng)傷愈合能力在SIRT1穩(wěn)定敲除組較陰性對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)，Transwell實(shí)驗(yàn)證明了敲除SIRT1顯著降低了MHCC97H細(xì)胞的遷移能力(P＜0.01)和損傷了

9、MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力。另外，SIRT1過表達(dá)明顯增加了肝細(xì)胞株L02細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P＜0.05)。因此，以上結(jié)果表明SIRT1的表達(dá)可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞體外的遷移和侵襲能力。裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)中，熒光信號(hào)分析顯示SIRT1敲除的MHCC97H細(xì)胞形成的全身轉(zhuǎn)移較對(duì)照組明顯減少(P＜0.01)，肝癌細(xì)胞MHCC97H在肝臟表面形成的轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)在SIRT1敲除組較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)，肝癌細(xì)胞MHCC97H的肺轉(zhuǎn)移發(fā)

10、生率在SIRT1敲除組較對(duì)照組明顯降低。綜上所述，SIRT1的表達(dá)可促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　(3)肝癌細(xì)胞MHCC97H，SK-Hep1敲除SIRT1和Huh7細(xì)胞中過表達(dá)SIRT1后，EMT上皮標(biāo)志物(E-cadherin，CK-18)，間質(zhì)標(biāo)志物(vimentin，α-SMA)和轉(zhuǎn)錄因子(snail，twi st)的蛋白表達(dá)水平無明顯變化。肝癌細(xì)胞MHCC97H敲除SIRT1對(duì)一系列EMT關(guān)鍵標(biāo)志物(E-cadherin，

11、fibronectin，vimentin，twist，and snail)的mRNA水平無明顯影響。免疫熒光染色顯示在肝癌細(xì)胞MHCC97H和SK-Hep1中沉默SIRT1的表達(dá)不能誘導(dǎo)EMT的進(jìn)程。缺氧環(huán)境中肝癌細(xì)胞HepG2過表達(dá)SIRT1也不能影響EMT標(biāo)志物的表達(dá)。TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌EMT模型中，SIRT1的表達(dá)水平無明顯變化。以上結(jié)果表明SIRT1的表達(dá)對(duì)肝癌EMT的進(jìn)程無明顯的影響。肝癌細(xì)胞MHCC97H在穩(wěn)定敲除SIR

12、T1后，線粒體的質(zhì)量、線粒體DNA拷貝數(shù)、線粒體DNA轉(zhuǎn)錄本(COXⅠ，ND1，ND6)、細(xì)胞內(nèi)ATP水平和線粒體發(fā)生相關(guān)基因(Tfam，COXⅣ，TOMM20)的蛋白水平均明顯降低，以上結(jié)果表明肝癌細(xì)胞中敲除SIRT1降低了線粒體發(fā)生的能力及損傷了線粒體的功能，導(dǎo)致了生物能量產(chǎn)生的缺陷。臨床標(biāo)本研究中SIRT1的過表達(dá)與PGC-1α的上調(diào)在肝癌組織相對(duì)于相鄰的非腫瘤組織存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.569，P＜0.001);在肝癌細(xì)胞

13、MHCC97H和Huh7中過表達(dá)SIRT1可明顯增加PGC-1α的表達(dá)水平，而MHCC97H細(xì)胞中敲除SIRT1可明顯升高PGC-1α的乙?；綇亩档土薖GC-1α的活性。而在肝癌細(xì)胞Huh7，MHCC97H中過表達(dá)PGC-1α明顯增加了細(xì)胞的遷移、侵襲能力，提高了細(xì)胞的線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體DNA編碼基因(COXⅠ，ND1，ND6)的mRNA水平，該結(jié)果表明PGC-1α促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲通過增強(qiáng)線粒體的發(fā)生而介導(dǎo)的。過表

14、達(dá)PGC-1α明顯恢復(fù)了肝癌細(xì)胞MHCC97H因敲除SIRT1所致的降低的遷移和侵襲能力，同時(shí)，線粒體DNA拷貝數(shù)，線粒體DNA轉(zhuǎn)錄本(COXⅠ，ND1，ND6)，細(xì)胞內(nèi)ATP水平和線粒體發(fā)生相關(guān)基因(Tfam，COXⅣ，TOMM20)的蛋白水平在過表達(dá)PGC-1α而敲除SIRT1的MHCC97H組中較單獨(dú)敲除SIRT1的MHCC97H細(xì)胞組明顯增高，該結(jié)果表明過表達(dá)PGC-1α可逆轉(zhuǎn)SIRT1敲除對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和線粒體發(fā)生降低的抑制效

15、應(yīng)。在裸鼠原位抑制模型中，肝癌細(xì)胞SIRT1敲除組的熒光信號(hào)強(qiáng)度和肺組織腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量較對(duì)照組明顯降低，而過表達(dá)PGC-1α后可逆轉(zhuǎn)該抑制效應(yīng)，而來源于裸鼠轉(zhuǎn)移性肺組織的線粒體DNA拷貝數(shù)，線粒體DNA轉(zhuǎn)錄本(COXⅠ，ND1，ND6)及線粒體發(fā)生相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平在敲除SIRT1的MHCC97H組中較對(duì)照組明顯降低，而過表達(dá)PGC-1α后可恢復(fù)其表達(dá)水平，該結(jié)果表明PGC-1α介導(dǎo)的線粒體發(fā)生增強(qiáng)在SIRT1促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)

16、鍵作用。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，SIRT1普遍高表達(dá)于肝癌組織，且其相對(duì)表達(dá)水平與肝癌微血管侵犯，腫瘤TNM分期，肝癌的復(fù)發(fā)和綜合生存率具有明顯的相關(guān)性，表明SIRT1的表達(dá)水平可作為評(píng)估肝癌轉(zhuǎn)移的有效的預(yù)后指標(biāo)。敲除SIRT1明顯降低肝癌細(xì)胞的體外侵襲和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)敲除SIRT1可明顯降低線粒體發(fā)生的水平和減少ATP的產(chǎn)生，但卻不影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的進(jìn)程。肝癌組織中SIRT1的過表達(dá)與PGC-

17、1α的上調(diào)明顯相關(guān)，而肝癌細(xì)胞中外源性過表達(dá)SIRT1明顯增加PGC-1α的表達(dá)水平，敲除SIRT1的表達(dá)可降低PGC-1α的活性。通過細(xì)胞株及肝臟原位移植模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)PGC-1α的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)敲除SIRT1所致的肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的降低，是通過增強(qiáng)線粒體的發(fā)生而介導(dǎo)。通過該研究，闡明了SIRT1促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，為探索高效的用于SIRT1/PGC-1α軸的靶向治療提供理論依據(jù)，為豐富肝癌的個(gè)體化治療和提高預(yù)后具有積極的意義。