SIRT1和PGC-1α在糖尿病大鼠海馬組織中的表達(dá)及津力達(dá)的干預(yù)影響.pdf

1、背景介紹:
　　 糖尿病是一種以血糖增高為特征的多病因代謝疾病。大量的流行病學(xué)研究提示，糖尿病已是認(rèn)知功能障礙的重要危險(xiǎn)因素，主要以輕中度的認(rèn)知功能受損為特征，同時(shí)伴有大腦結(jié)構(gòu)、神經(jīng)功能及神經(jīng)精神等方面的病理性改變，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前研究提示氧化應(yīng)激在糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)是新出現(xiàn)的在抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮著

2、重要作用，而沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)則可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激條件下PGC-1α的起始和持續(xù)反應(yīng)，對(duì)PGC-1α生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮起積極作用，被認(rèn)為與PGC-1α共同構(gòu)成了一個(gè)神經(jīng)保護(hù)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。
　　 糖尿病慢性并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，目前，控制和延緩糖尿病并發(fā)癥，降低死亡率至關(guān)重要。然而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏理想藥物及有效方法，最近，一些中藥制劑在改善糖尿病并發(fā)癥癥狀，增強(qiáng)體質(zhì)等方面表現(xiàn)出了較好的療效。糖尿病認(rèn)知功能障礙，在中醫(yī)學(xué)上，歸屬

3、于“消渴”病合并呆病、健忘等范疇，病機(jī)是臟腑陰虛為本，病位在肺、脾、腎三臟，病久陰虛及陽(yáng)，則三臟虧虛，功能失調(diào)，運(yùn)化水濕功能減弱，加劇痰濁形成。故治療的重點(diǎn)為健脾益氣，消痰利濕。津力達(dá)顆粒以人參、黃精、蒼術(shù)、苦參、麥冬、地黃、制何首烏、山茱萸、茯苓、佩蘭、黃連、知母、淫羊藿（炙）丹參為成分，主要功用為益氣養(yǎng)陰、健脾運(yùn)津，用于氣陰兩虛證，具有治療消渴之功效。由此，我們可以推測(cè)，津力達(dá)顆?？赡芫哂斜Ｗo(hù)糖尿病患者認(rèn)知功能的作用。
　　

4、 目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測(cè)2型糖尿病大鼠腦組織海馬區(qū)SIRT1和PGC-1α表達(dá)及氧化應(yīng)激水平，同時(shí)觀察大鼠海馬組織的細(xì)胞凋亡及電鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化情況，旨在探討SIRT1和PGC-1α在糖尿病腦病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。并觀察不同劑量津力達(dá)顆粒對(duì)2型糖尿病大鼠海馬組織的保護(hù)作用，檢測(cè)其對(duì)SIRT1和PGC-1α表達(dá)及組織氧化應(yīng)激水平的影響，從而為復(fù)方中藥制劑津力達(dá)顆粒在治療和延緩糖尿病認(rèn)知功能障礙的臨床應(yīng)用上提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，

5、并探討其可能的機(jī)制。
　　 方法:
　　 雄性SD大鼠88只，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2d后隨機(jī)分組，正常對(duì)照組12只給予普通飼料，其余各組大鼠均予高脂飼料，喂養(yǎng)4周。誘發(fā)出胰島素抵抗模型后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg;正常對(duì)照組給予同劑量的檸檬酸緩沖液腹腔注射。模型驗(yàn)證:2周后讓大鼠禁食8h后行口服糖耐量試驗(yàn)，凡0min和120min血糖分別大于7.0 mmol/L和11.0 mmol/L的大鼠，作為2型糖

6、尿病造模成功大鼠。本組造模成功大鼠74只，隨機(jī)剔除2只，其余大鼠隨機(jī)分為模型組、津力達(dá)低劑量組(0.75 g/kg）、津力達(dá)中劑量組(1.5 g/kg)、津力達(dá)高劑量組(3.0g/kg)、α-硫辛酸組(50mg/kg)、胰島素組（諾和靈N，1.5U/kg），每組12只。除胰島素采用皮下注射外，其他藥物均采用0.5％羥甲基纖維素鈉溶解均勻后灌胃給藥。正常對(duì)照組與模型組均用同等體積的羥甲基纖維素鈉灌胃。每日給藥1次，連續(xù)處理2個(gè)月。8周后對(duì)

7、各組大鼠行morris水迷宮檢測(cè)其認(rèn)知功能，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，western blot方法分別檢測(cè)各組海馬組織中PGC-1α mRNA的表達(dá)及SIRT1及PGC-1α蛋白的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量;并行TUNEL凋亡染色觀察其神經(jīng)細(xì)胞損害情況及透射電鏡檢測(cè)其超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組大鼠一般情況
　　 正常對(duì)照組大鼠一般情況良好，精神狀

8、態(tài)佳，活動(dòng)自如，毛發(fā)光澤，飲食及大小便正常，無死亡;模型組大鼠一般情況較差，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)雜亂無光，出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象。各藥物組此種情況均有不同程度改善。
　　 2.Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果
　　 與正常對(duì)照組相比，模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，各藥物治療組除津力達(dá)低劑量組較模型組潛伏期無明顯改善外，其余組潛伏期均有不同程度的縮短(P＜0.05)，其中胰島素組效果最為顯著，與正常對(duì)照組比較，無顯

9、著差異(P＞0.05)。其次為α-硫辛酸組及津力達(dá)高劑量組，其潛伏期較正常組有所延長(zhǎng)(P＜0.05)，但與胰島素組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.光鏡檢查結(jié)果
　　 正常對(duì)照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列較規(guī)則、緊密，細(xì)胞界限清楚，細(xì)胞帶較完整;模型組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列散亂，稀疏分布不均勻，神經(jīng)細(xì)胞脫失嚴(yán)重，并可觀察到比例較高的顏色棕染的凋亡細(xì)胞。各藥物治療組的情況較模型組均有不同程度的改善，其中津力達(dá)中

10、、高劑量組、α-硫辛酸組及胰島素組改善顯著。
　　 4.透射電鏡檢查結(jié)果
　　 正常對(duì)照組細(xì)胞核染色質(zhì)分布較均勻，大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整，偶見線粒體嵴破壞;模型組細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰，細(xì)胞核有凝集現(xiàn)象，有較多線粒體結(jié)構(gòu)不完整，線粒體嵴破壞;津力達(dá)低劑量組部分細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，部分細(xì)胞核染色質(zhì)分布不均勻，大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整，少量線粒體嵴破壞。津力達(dá)中劑量組部分細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，呈塊狀，大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整，少量線粒體嵴破壞。津力

11、達(dá)高劑量組染色質(zhì)凝集在細(xì)胞核邊緣，分布不均勻，部分線粒體嵴破壞。α-硫辛酸組染色質(zhì)呈塊狀凝集，凝集的染色質(zhì)主要分布在細(xì)胞核邊緣，部分線粒體嵴破壞。胰島素組部分細(xì)胞核染色質(zhì)分布較均勻，部分細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，部分線粒體破壞，胞質(zhì)內(nèi)有少量空泡。
　　 5.自由基及抗氧化酶指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
　　 與正常對(duì)照組相比，模型組超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)含量明顯降低，丙二醛(MDA)含量增多，各藥物治療組可不同程

12、度的提高組織抗氧化酶的含量，降低MDA含量，其中以胰島素、α-硫辛酸、津力達(dá)高劑量組效果顯著。津力達(dá)高劑量組能明顯提高海馬組織SOD水平，其效果與α-硫辛酸相媲美(P＜0.05)，但比胰島素略差;對(duì)于GSH，津力達(dá)高劑量組能明顯增加其水平，其效果比α-硫辛酸、胰島素略差，對(duì)于MDA水平，胰島素組效果最為顯著，其次為α-硫辛酸，津力達(dá)高劑量組和中劑量組效果相當(dāng)(P＜0.05)。
　　 6.各組大鼠海馬組織PGC-1αmRNA表達(dá)量

13、及PGC-1α、SIRT1蛋白表達(dá)量
　　 模型組與正常組相比，其PGC-1α mRNA及SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)量均明顯降低(P＜0.05)，各藥物治療組均能不同程度提高PGC-1α mRNA及SIRT1蛋白的含量(P＜0.05)，其中以胰島素、α-硫辛酸及津力達(dá)高劑量組效果最為顯著。而PGC-1α蛋白的表達(dá)，與模型組相比較，α-硫辛酸及胰島素能夠明顯提高其蛋白含量，津力達(dá)中高劑量組雖有一定程度增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、，不過津力達(dá)高劑量組的效果仍明顯優(yōu)于低、中劑量組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 2型糖尿病可使大鼠出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙，其海馬組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，細(xì)胞凋亡嚴(yán)重。海馬組織PGC-1α mRNA及其蛋白、SIRT1蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)，而抗氧化酶SOD、GSH表達(dá)降低，MDA水平上調(diào)。津力達(dá)顆?？筛纳?型糖尿病大鼠的認(rèn)知功能障礙，并保護(hù)其海馬組織，其療效與α-硫辛酸相媲美。津力達(dá)的神經(jīng)保護(hù)作用，可能部分是通過調(diào)節(jié)SI