β-arrestin1通過介導(dǎo)HIF1α依賴的PKM2表達參與胃癌的發(fā)生.pdf

1、目的:
　　研究β-arrestin1在調(diào)節(jié)腫瘤代謝中的分子機制，以及該機制在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，為防治胃癌的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)，為抑制癌癥發(fā)生的藥物研究提供靶點。
　　方法:
　　1.在組織水平上，從臨床標本（癌旁正常組織和胃癌）中，通過免疫組化方法檢測β-arrestin1在細胞中的定位和表達情況，在檢測HIF1α、PKM2在組織標本中的表達水平，初步確定這三個分子之間的相關(guān)性。
　　2.在分子水平上，

2、應(yīng)用幽門螺桿菌的毒力因子CagA高表達質(zhì)粒處理細胞，通過實時定量以及Westernblotting檢測其對β-arrestin1在mRNA和蛋白水平表達的影響，并檢測該處理對HIF1α和PKM2的表達水平的影響;同時，通過免疫熒光和熒光素酶活性檢測檢測β-arrestin1與HIF1α以及PKM2之間的相互作用;另外，還通過β-arrestin1的siRNA以及對應(yīng)的NCsiRNA干擾掉細胞內(nèi)β-arrestin1的表達，檢測HIF1α

3、和PKM2的表達水平，從而進一步明確這三個分子之前的相關(guān)性，具體方法如下:
　　1)利用羅氏轉(zhuǎn)染試劑把CagA的高表達質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胃癌細胞AGS、BGC-823和永生化細胞GES-1中，48小時后收細胞，用Trizol提取總RNA，再用Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA后用實時定量PCR檢測β-arrestin1及其HIF-A和PKM2mRNA的表達水平，蛋白水平的檢測用Western Blotting方法。

4、
　　2)利用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑把β-arrestin1的siRNA以及對應(yīng)的NCsiRNA轉(zhuǎn)入胃癌細胞AGS、BGC-823和永生化細胞GES-1中，72小時后收細胞，用Trizol提取總RNA，再用Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA后用實時定量PCR檢測β-arrestin1及其HIF-A和PKM2mRNA的表達水平，蛋白水平的檢測用WesternBlotting方法。
　　3)CagA的高表達質(zhì)粒及

5、其對照質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入胃癌細胞AGS和BGC-823中12小時后，經(jīng)4％多聚甲醛固定細胞后，進行免疫熒光試驗(immuno fluorescence test)，檢測β-arrestin1和HIF1α的細胞內(nèi)分布情況以及相關(guān)。
　　4)CagA的高表達質(zhì)粒和帶有HRE位點的報告基因質(zhì)粒分別被共轉(zhuǎn)染入胃癌細胞AGS和BGC-823中48小時后，通過熒光素酶活性檢測檢測CagA對HIF1α與PKM2相互結(jié)合的影響;應(yīng)用β-arrestin1

6、的siRNA以及對應(yīng)的NCsiRNA干擾掉細胞內(nèi)β-arrestin1的表達，再將CagA的高表達質(zhì)粒和帶有HRE位點的報告基因質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染入胃癌細胞AGS和BGC-823中48小時后，通過熒光素酶活性檢測檢測CagA對HIF1α與PKM2相互結(jié)合的影響。
　　3.在動物水平上，通過摘眼球取已建立的小鼠感染模型的C57小鼠的血，用南京建成生物工程公司生產(chǎn)的葡萄糖測試盒和乳酸測試盒分別檢測小鼠血中葡萄糖以及乳酸的含量，明確在幽門螺

7、桿菌持續(xù)感染的情況下，小鼠體內(nèi)代謝所發(fā)生的明顯改變，從而說明幽門螺桿菌的持續(xù)感染對代謝的影響以及在胃癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用。
　　結(jié)果:
　　1.在組織水平檢測中，β-arrestin1、HIF1α和PKM2的表達在胃癌組織標本中比癌旁正常組織中的表達顯著升高。
　　2.胃癌細胞AGS、BGC-823和永生化細胞GES-1中轉(zhuǎn)入CagA高表達質(zhì)粒48小時后，β-arrestin1的mRNA和蛋白水平的表達明顯升高，H

8、IF1α和PKM2的表達也明顯升高。CagA高表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胃癌細胞AGS和BGC-823中12小時后，通過免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)入核的β-arrestin1較對照組的明顯增加，且HIF1α的分布較對照組更加規(guī)律，部分出現(xiàn)β-arrestin1和HIF1α共定位的現(xiàn)象。
　　3.胃癌細胞AGS、BGC-823中轉(zhuǎn)入β-arrestin1siRNA72小時后，β-arrestin1的mRNA和蛋白水平的表達幾乎沒有，HIF1α和PKM2的

9、表達出現(xiàn)明顯下降。
　　4.在胃癌細胞AGS和BGC-823中共轉(zhuǎn)染CagA高表達質(zhì)粒和報告基因質(zhì)粒48小時后，通過熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，較之空白對照組，熒光素酶活性顯著升高;而干擾掉細胞內(nèi)β-arrestin1的表達后，再共轉(zhuǎn)染CagA高表達質(zhì)粒和報告基因質(zhì)粒48小時后，熒光素酶活性較之空白對照組出現(xiàn)明顯下降現(xiàn)象。
　　5.通過取小鼠血檢測血清中葡萄糖和乳酸的含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過幽門螺桿菌持續(xù)感染的小鼠較對照組小鼠，血清中葡