肝素及低分子肝素質(zhì)量控制相關(guān)對(duì)照品及標(biāo)準(zhǔn)試劑的研究.pdf

1、肝素是廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病和血液透析臨床治療的最有效抗凝藥物，除具有抗凝作用外，還有許多其他的生物活性及臨床用途。低分子肝素是由肝素為原料進(jìn)一步加工而成的一大類抗血栓藥物，臨床用途更為廣泛，已成為治療急性靜脈血栓和急性慣性冠脈綜合癥等疾病的首選藥物，占抗栓類藥物的市場(chǎng)份額不斷增大。我國(guó)擁有全球最豐富的肝素原料資源，是肝素鈉原料藥生產(chǎn)和出口的大國(guó)。而隨著對(duì)低分子肝素的深入研究，國(guó)內(nèi)低分子肝素類產(chǎn)品的生產(chǎn)廠家也在不斷增加。肝素及低分子肝素

2、的質(zhì)量直接影響到這兩個(gè)品種的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，關(guān)系到人民群眾的用藥安全。控制好肝素及低分子肝素的質(zhì)量至關(guān)重要。
　　2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)肝素鈉進(jìn)行了修訂，增加了分子量及分子量分布測(cè)定項(xiàng)目，并把活性測(cè)定方法由凝血法改為生色底物法。而新版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)也依據(jù)品種的不同對(duì)低分子肝素進(jìn)行了分類提高。細(xì)化了分子量與分子量分布、活性測(cè)定等項(xiàng)目的限度和操作過(guò)程，并增加了鑒別、雜質(zhì)檢查等項(xiàng)目。這些檢驗(yàn)項(xiàng)目中需用到的對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)試劑等目前只能依靠

3、國(guó)外進(jìn)口，實(shí)驗(yàn)成本很高，質(zhì)量難以控制，急需國(guó)產(chǎn)化。本文旨在對(duì)肝素及低分子肝素重要質(zhì)量控制項(xiàng)目中使用到的對(duì)照品及標(biāo)準(zhǔn)試劑進(jìn)行研究，通過(guò)前期的原料篩選，建立合適的標(biāo)定方法，制備標(biāo)定肝素及低分子肝素的國(guó)家對(duì)照品及標(biāo)準(zhǔn)試劑，用以規(guī)范檢驗(yàn)部門及生產(chǎn)企業(yè)的實(shí)驗(yàn)操作，提高國(guó)內(nèi)肝素及低分子肝素的質(zhì)量，增強(qiáng)國(guó)產(chǎn)肝素及低分子肝素在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。
　　本文共分為以下三個(gè)部分的內(nèi)容：
　　第一部分針對(duì)分子量及分子量分布檢測(cè)項(xiàng)目，建立肝素及低分

4、子肝素的分子量測(cè)定用對(duì)照品的標(biāo)定方法，對(duì)兩個(gè)品種的分子量測(cè)定用待標(biāo)品進(jìn)行標(biāo)定。肝素及低分子肝素的分子量與分子量分布與其抗凝活性有著密切關(guān)系。目前常用的分子量測(cè)定方法為高效凝膠色譜法，需使用分子量對(duì)照品。本文分別溯源到USP肝素分子量對(duì)照品與WHO低分子肝素分子量對(duì)照品，采用高效凝膠色譜法對(duì)這兩個(gè)品種的分子量待標(biāo)品進(jìn)了標(biāo)定賦值。并使用這兩個(gè)品種的待標(biāo)品與國(guó)際對(duì)照品，對(duì)國(guó)內(nèi)主要生產(chǎn)廠家的肝素及低分子肝素樣品的分子量及分子量分布進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)

5、果一致，無(wú)顯著差異。肝素及低分子肝素分子量待標(biāo)品可作為分子量測(cè)定首批國(guó)家對(duì)照品使用。
　　第二部分針對(duì)活性測(cè)定項(xiàng)目中使用的兩個(gè)生色底物進(jìn)行標(biāo)定。2015版《中國(guó)藥典》中的肝素活性測(cè)定項(xiàng)目及新版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的低分子肝素活性測(cè)定項(xiàng)目均收錄了抗Ⅹa因子及抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定方法。該方法需要使用兩個(gè)小肽類生色底物，分別為S-2765及S-2238。本文根據(jù)底物的性質(zhì)及用途分別設(shè)置了鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定、低分子肝素活性測(cè)定等項(xiàng)目，并與進(jìn)口底

6、物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明，待標(biāo)底物與進(jìn)口底物結(jié)構(gòu)一致，活性測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。待標(biāo)底物的雜質(zhì)含量在可控范圍內(nèi)。待標(biāo)底物可作為活性測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)試劑使用。
　　第三部分針對(duì)依諾肝素鈉的特征結(jié)構(gòu)—非還原端的1,6-脫水衍生物含量測(cè)定項(xiàng)目中使用的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進(jìn)行標(biāo)化。肝素酶對(duì)依諾肝素鈉的酶解效果對(duì)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響較大。本文針對(duì)肝素酶的性質(zhì)、使用特點(diǎn)及用途，分別設(shè)置項(xiàng)目對(duì)蛋白濃度、分子量、純度及酶活進(jìn)行了研究，建立了標(biāo)化方法并

7、賦值，結(jié)果符合要求，標(biāo)化的三個(gè)肝素酶可以作為依諾肝素鈉1,6-脫水衍生物含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)試劑使用。
　　本文對(duì)肝素及低分子肝素重要質(zhì)量控制項(xiàng)目中需要使用的對(duì)照品以及標(biāo)準(zhǔn)試劑進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化研究。標(biāo)定出肝素及低分子肝素分子量測(cè)定用首批國(guó)家對(duì)照品，填補(bǔ)了我國(guó)這兩個(gè)品種的分子量測(cè)定用對(duì)照品的空白。標(biāo)定出肝素及低分子肝素活性測(cè)定用生色底物標(biāo)準(zhǔn)試劑及依諾肝素鈉1,6-脫水衍生物含量測(cè)定用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)試劑，改善了依賴進(jìn)口試劑的現(xiàn)狀。本文標(biāo)定