抗氧化劑對冷凍人顆粒脂肪組織的保護(hù)作用.pdf

1、背景：自體脂肪是一種理想的填充材料，幾乎可用于全身各個部位的軟組織缺損治療，在整形外科中廣泛應(yīng)用。有研究報道，采用取自上臂小塊脂肪組織游離移植填充下眶緣軟組織缺損獲得了良好的美容效果，認(rèn)為抽取自體脂肪進(jìn)行注射移植這種方法是值得推廣的。然而目前填充移植后保存的脂肪組織體積最終只有注射時的20-30％左右。為了達(dá)到滿意的填充效果，臨床上常常需要進(jìn)行再次或者多次填充移植。反復(fù)的脂肪抽取操作既增加了醫(yī)生的工作量，又增加了患者為取材而吸脂的手術(shù)痛

2、苦和手術(shù)風(fēng)險，并造成較高的費用。在此背景下如能通過一次吸脂手術(shù)獲得足夠的脂肪組織，同時將獲取的脂肪進(jìn)行體外長期冷凍儲存，在需要時復(fù)溫即可使用，是廣大醫(yī)生和患者的迫切愿望，同時也具有重要的臨床應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值，冷凍過程最關(guān)鍵的是冷凍保護(hù)劑的選用。但目前國內(nèi)外關(guān)于人顆粒脂肪組織冷凍保護(hù)劑的研究尚少，用于凍存其他細(xì)胞或組織時的冷凍保護(hù)劑是否可保持冷凍保存脂肪組織中細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)和活力的研究還鮮見報道。通常認(rèn)為在冷凍保存過程中細(xì)胞損傷主要來自

3、兩方面：一是降溫時細(xì)胞內(nèi)生成粗大的樹枝狀冰晶直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；另一方面則是細(xì)胞在降溫過程中氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多過氧化物，使細(xì)胞活力受損，加速了細(xì)胞的凋亡。
　　目的：本次研究在基礎(chǔ)凍存液中添加目前臨床較常使用的抗氧化劑來進(jìn)行人顆粒脂肪組織的凍存，觀察復(fù)溫后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)代謝、及細(xì)胞活性等方面的變化，初步探討添加抗氧化劑是否更有利于人顆粒脂肪組織的凍存，為自體脂肪注射移植實現(xiàn)“一次凍存，長期使用”的目標(biāo)和提高凍存后人顆粒脂肪組織移植的成活率

4、，減少患者的痛苦和醫(yī)生的工作量，提供相關(guān)理論支持和基礎(chǔ)實驗依據(jù)。
　　方法：以配制滲透性玻璃化冷凍保護(hù)劑（生理鹽水+8%二甲基亞砜）為基礎(chǔ)液，分別以不同濃度的抗氧化劑超氧化物歧化酶（100,200,400,600 IU/mL），谷胱甘肽（1,5,10,15 mmol/L）和生育酚（維生素E，1,1.5,2,2.5 mg/mL）配制凍存液；再與抽取獲得經(jīng)分離提純后的人顆粒脂肪組織混合均勻，置于-4℃冰箱中凍存2個月后取出；復(fù)溫后通過

5、組織石蠟包埋切片 HE染色觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)是否完整，組織冰凍切片油紅O染色觀察脂肪細(xì)胞中脂滴形態(tài)，以及ROS檢測盒熒光染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi) ROS含量，碘化丙錠（PI）染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡，觀察分析添加抗氧化劑凍存后人顆粒脂肪組織中細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)、代謝及活力改變。
　　結(jié)果：HE染色顯示，經(jīng)單純PS+8%DMSO基礎(chǔ)凍存液凍存的人顆粒脂肪組織復(fù)溫后組織結(jié)構(gòu)不均勻，鏡下可見大片囊樣脂池和壞死區(qū)。而100-600 IU/mL S

6、OD（或1-15 mmol/L GSH或1-2.5 mg/mL VE）+PS+8%DMSO凍存組復(fù)溫后脂肪組織結(jié)構(gòu)較均勻，大的囊樣脂池形成較少。油紅 O染色顯示，經(jīng)單純PS+8%DMSO基礎(chǔ)凍存液凍存的脂肪組織復(fù)溫后脂肪組織中脂滴大部分破裂，少見藍(lán)色胞核，而100-600 IU/mL SOD（或1-15 mmol/L GSH或1-2.5 mg/mL VE）+PS+8%DMSO凍存的可見部分藍(lán)染胞核，紅色脂滴，但形態(tài)欠佳。ROS檢測盒熒光

7、標(biāo)記流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù)成圖顯示，單純 PS+8%DMSO基礎(chǔ)凍存液組顆粒脂肪組織的熒光含量峰值最高，多于其他實驗組（P<0.05）。以不同濃度 SOD（或GSH或VE）+PS+8%DMSO為冷凍保護(hù)劑凍存顆粒脂肪組織，8周后復(fù)溫，通過PI單染的流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，SOD+PS+8%DMSO凍存組凋亡細(xì)胞曲線峰均低于單純PS+8%DMSO基礎(chǔ)凍存液凍存組（P<0.05）。
　　結(jié)論：1.用常規(guī)凍存液含8%二甲基亞砜生理