Ad5F11p-GFP對(duì)免疫細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及Ad5F11p-WT1-CAR的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、 Ad5F11p-GFP 對(duì)免疫細(xì)胞生物學(xué)特性的影 對(duì)免疫細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及 響及 Ad5F11p-WT1/CAR 的構(gòu)建和鑒定 的構(gòu)建和鑒定 Influence Ad5F11p-GFP vector on the biological characteristics of immune cells and construction and identification of Ad5F11p-WT1/CAR 專 業(yè)：制藥工程

2、 作者姓名：徐贊美 指導(dǎo)老師：吳祖澤 院士 天津大學(xué)化工學(xué)院 二零一五年五月 摘 要 嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptors，CAR）由單鏈抗體的可變區(qū)和免疫細(xì)胞信號(hào)分子組成。將 CAR 以基因工程的方法表達(dá)于免疫細(xì)胞表面再過(guò)繼輸注的治療方式稱為 CAR 療法, CAR 療法是一種新型的過(guò)繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療(ACT)策略，涉及到重新定向免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)其攻擊腫瘤細(xì)胞的過(guò)程。 Ad5F11p-GFP 載體是一種

3、在 Ad5（5 型腺病毒）基礎(chǔ)上建立的，攜帶報(bào)告基因 GFP 和 Ad11p 靶向性基因的新型重組腺病毒。本研究用 Ad5F11p-GFP 以不同的 MOI(感染復(fù)數(shù)) 感染原代 NK 細(xì)胞、CIK 細(xì)胞以及免疫細(xì)胞系 NK-92 細(xì)胞；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例，進(jìn)行熒光顯微鏡照相，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)分析細(xì)胞的增殖，并用 LDH 法檢測(cè) NK-92 對(duì)白血病細(xì)胞系 K562 和 HL-60的殺傷作用。 結(jié)果表明：25MOI 的 A

4、d5F11p-GFP 對(duì) NK-92 的感染效率可以達(dá)到大約 90%，200MOI Ad5F11p-GFP 對(duì) CIK 感染效率不到 40%，Ad5F11p-GFP 對(duì)原代 NK 細(xì)胞的感染效率更低；同一 MOI Ad5F11p-GFP 在 48h 和 96h 感染效率基本不變；感染 Ad5F11p-GFP 病毒的免疫細(xì)胞容易聚團(tuán)，增殖減慢，IFN-γ的釋放增加并且對(duì)腫瘤的殺傷活性增強(qiáng)。結(jié)論：Ad5F11p 載體在以 NK-92 為效應(yīng)

5、細(xì)胞的基因修飾免疫治療中有較好的應(yīng)用前景。 Wilms'腫瘤基因（Wilms' tumor gene，WT1）是最早發(fā)現(xiàn)的與 Wilms'腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的基因，其等位基因的功能缺失可導(dǎo)致 Wilms'腫瘤。WT1 的表達(dá)只在胎兒腎臟、睪丸及卵巢等組織中表達(dá)。WT1 在白血病細(xì)胞中高度表達(dá)并與白血病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。鑒于以上知識(shí)我們進(jìn)行了以下研究。目的：構(gòu)建一種腺病毒 WT1-CAR 體系，用來(lái)

6、修飾 NK-92，并用于治療血液系統(tǒng)腫瘤。方法：我們?cè)O(shè)計(jì)了一種特異性好但還未上市的 CAR：WT1-CAR。WT1-CAR 由WT1 識(shí)別區(qū)，鉸鏈區(qū)，CD28 跨膜區(qū)，以及 CD28/41-BB/ CD3?信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)組成。在信號(hào)肽后加上 EcoRI 位點(diǎn)，在 VH 后加上 BamHI 位點(diǎn)，只要用 EcoRI/BamHI雙酶切，就能克隆至 pIR-IgG2N/IFN-Fc 傳輸質(zhì)粒中，形成靶向長(zhǎng)效干擾素表達(dá)質(zhì)粒。將 WT1-CAR 裝載

7、到 pShuttle-CMV 質(zhì)粒上，記作 pShuttle-CMV-WT1。將pShuttle-CMV-WT1 與骨架質(zhì)粒 AdEasy-1/F1lp 重組后， 用 Lip2000 感染試劑將其轉(zhuǎn)入 HEK293 細(xì)胞中包裝病毒， 然后分別在基因水平和蛋白水平鑒定。 最后進(jìn)行擴(kuò)增和純化。結(jié)果：成功包裝出表達(dá)表達(dá) WT1-CAR 融合基因的重組 Ad5F11p病毒,記作 Ad5F11p-WT1/CAR。結(jié)論：腺病毒載體 Ad5F11p