Ad5-GFP的大規(guī)模擴(kuò)增、純化及生物活性的研究.pdf

1、目的：通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索腺病毒大規(guī)模擴(kuò)增的條件、細(xì)胞破碎的最優(yōu)方法、硫酸銨沉淀的最適濃度、疏水柱及離子交換柱聯(lián)用純化腺病毒的最佳工藝、腺病毒最佳的保存條件、最后通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究純化后的腺病毒活性。
　　方法：以腺病毒的滴度、純度和回收率來(lái)考察最后的結(jié)果。
　　一、比較不同MOI值、感染時(shí)間下腺病毒的滴度，用于確定大規(guī)模擴(kuò)增的最佳條件。
　　二、比較反復(fù)凍融法、超聲波法和高壓滲透壓法后腺病毒的滴度，確定細(xì)胞破碎的最佳方法。

2、
　　三、配置不同百分比的飽和硫酸銨來(lái)沉淀腺病毒，比較回收率后確定最適合的飽和硫酸銨濃度。
　　四、比較不同疏水柱類(lèi)型和鹽濃度、陰離子交換柱的類(lèi)型，通過(guò)腺病毒的滴度、純度和回收率來(lái)確定最適合的工藝條件。
　　五、采用正交設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)的方法確定腺病毒的最適合保存條件。
　　六、通過(guò)ELISA法比較純化前后腺病毒在體內(nèi)體外綠色熒光蛋白的表達(dá)量，以及蛋白的表達(dá)量隨腺病毒感染的滴度、時(shí)間的變化。
　　本實(shí)驗(yàn)參考了相關(guān)

3、文獻(xiàn)后，設(shè)計(jì)了用硫酸銨沉淀法將腺病毒上清中的腺病毒濃縮粗純，不經(jīng)過(guò)處理直接上疏水柱，再過(guò)離子交換柱的辦法來(lái)純化腺病毒，最后通過(guò)體內(nèi)體外比較純化前后的蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　一、腺病毒大規(guī)模擴(kuò)增的最佳條件為：MOI值為10、感染時(shí)間為24小時(shí)，收獲的腺病毒滴度最高。
　　二、比較反復(fù)凍融法、超聲波法和高壓滲透壓法發(fā)現(xiàn)超聲波法破碎細(xì)胞的效果最好，破損率等達(dá)到96％。
　　三、通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硫酸銨沉淀法最適合濃度為

4、60%的飽和硫酸銨，回收率能達(dá)到70%。
　　四、使用美國(guó)GE Healthcare公司的Sepharose High Performance柱，在平衡緩沖液A液：2.5M（NH4）2SO4，40mM Tris-Hcl(pH8.0)、5%甘油、1mM MgCl2；洗脫緩沖液 B液：40mM Tris-Hcl(pH8.0)、5%甘油、1mM MgCl2下梯度洗脫20個(gè)柱體積，腺病毒回收率為79.6%。
　　五、使用陰離子交換柱

5、Qxl，在平衡平衡緩沖液A液：40mM Tris-Hcl(pH=8.0)、5%甘油、1mM MgCl2；平衡緩沖液B液：1M NaCl，40mM Tris-Hcl(pH=8.0)、5%甘油、1mM MgCl2下，梯度洗脫20個(gè)柱體積，腺病毒回收率為92.3%。最后的總回收率達(dá)到53.7%，純度為91.0%。
　　六、腺病毒的最適合保存條件為；-80度、5%甘油、1mM MgCl2。
　　七、純化后的腺病毒表達(dá)的的綠色熒光蛋白