腺病毒CNHK200-hEndostatin的質量控制及其大規(guī)模擴增、純化的初步研究.pdf

1、基因治療的基本原理是將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病的目的。 為此，本研究構建了一種能腫瘤細胞內特異性復制且高效表達人內皮抑素的基因一病毒載體系統(tǒng)，利用病毒在腫瘤細胞內特異性增殖及復制，從而高效表達人內皮抑素。這一系統(tǒng)在實驗研究中被證實對腫瘤的生長具有顯著的抑制作用，具有很好的臨床應用前景。 由于細胞的質量控制方法在以往的生物制品生產研究中已經趨

2、于成熟，所以本課題中討論的是對腺病毒本身進行質量控制所需要的方法的建立。 重組腺病毒產品CNHK200-hEndo是由載體DNA即腺病毒DNA和治療基因即人內皮抑素基因所構成，其基本質量指標包括鑒別實驗和效力實驗，是從腺病毒產品的鑒定、治療基因的存在、表達和生物學活性四個方面進行檢測。鑒別實驗包括限制性內切酶圖譜分析和治療基因的 PCR 鑒定，效力實驗包括基因表達檢測和生物學活性檢測，是進一步驗證存在于產品中的目的基因經腺病毒載

3、體介導后是否可在靶細胞中表達目的蛋白以及表達的目的蛋白是否具有生物學活性。 在本研究中，用SDS-PAGE方法對腺病毒進行蛋白鑒定，用限制性內切酶圖譜分析的方法對腺病毒進行DNA鑒定，結果表明樣品均符合目的腺病毒的要求。同時，應用PCR的方法來鑒定內皮抑素基因是否存在于該腺病毒DNA中，對于其表達情況和生物活性則使用ELISA的方法，結果表明該基因存在于該腺病毒DNA中并在細胞中能夠成功表達，具有生物活性。 本研究建立了

4、用陰離子交換層析方法檢測病毒顆粒數的方法，不僅對于樣品量的要求低，而且即使樣品中混有蛋白和DNA雜質也能得到有效的區(qū)分，使病毒顆粒數的計算更為準確和穩(wěn)定。 本研究采用建立的HPLC方法對純化的腺病毒CNK200-hEndo進行純度檢測，結果達到99％，完全達到臨床應用的要求。我們用PCR方法對野生型腺病毒進行檢測，擴增腺病毒CNHK200-hEndo中部分缺失而野生型腺病毒中仍然保存的E1B區(qū)。結果表明，這種方法完全可以用于檢測

5、野生型腺病毒基因組的存在，而進行檢測的腺病毒產品CNHK200-hEndo并未檢測到野生型腺病毒。殘余宿主DNA含量和殘余牛血清蛋白含量是腺病毒雜質檢測中重要的兩項，對于未來臨床應用的安全性具有重要意義。 在本研究中應用地高辛標記的探針對腺病毒樣品進行線雜交，其檢測敏感度高，可以檢測到1pg/ml的DNA含量，但是易出現假陰性和假陽性，仍需要進一步進行優(yōu)化和調整。殘余牛血清蛋白含量測定是應用中國藥品生物制品檢定所提供的常規(guī)檢測試

6、劑和方法，方法簡單，易于掌握，結果穩(wěn)定，可用于腺病毒的質量控制。 本研究參考國內外文獻以及結合自己的實踐經驗，將生產腺病毒的培養(yǎng)基定為含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。在應用反應器進行腺病毒擴增的過程中，由于細胞生長的情況將直接決定病毒的產量，因此，細胞培養(yǎng)載體的選擇也是十分重要的。293細胞的特點是貼壁的能力較差，易脫落和結團，由于固定床式反應器采用灌注培養(yǎng)方式而不需要細胞截流系統(tǒng)，貼壁能力差的細胞也能在該系統(tǒng)中很好地培養(yǎng)。我們

7、用此種方式培養(yǎng)293細胞，采用灌注培養(yǎng)，細胞接種后貼壁很快，接種1小時后細胞貼壁率可達98％以上。整個培養(yǎng)周期約7-10天，細胞增殖可達25-50倍。 腺病毒的產量不僅取決于宿主細胞的數量和生長狀況，其感染條件也是一個非常重要的因素。在感染條件中，病毒 MOI (Multiplity OfInfection，感染量)是一個最重要的因素。在灌注培養(yǎng)中，很重要的一個參數是灌注量的確定。由于病毒擴增是一個動態(tài)的過程，細胞在感染病毒后的

8、一系列代謝變化將改變常規(guī)生長狀態(tài)下對營養(yǎng)的需求量。通過檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的含量來跟蹤細胞的代謝變化，并通過維持不同水平的葡萄糖含量來研究灌注量對于病毒擴增的影響。結果發(fā)現，只有在合適的灌注量情況下，維持合適的葡萄糖濃度才能得到較高產量的腺病毒。 此外，通過實驗確定了生物反應器擴增腺病毒所涉及的其它參數，如載體量、攪拌轉速、感染時間、病毒上清的過濾孔徑等，基本建立了腺病毒通過反應器擴增的方法。按照上述方法，擴增了三批CNHK200

9、-hEndo腺病毒，結果總產量均達到10<'15>vp以上，比活性也基本符合要求，能夠滿足臨床試驗的需要量。腺病毒的純化，一直是用CsCl梯度超離心的方法。首先選擇了DEAE Sepharose F.F.、SOURCE 30 Q和Q Sepharose XL三種不同材質的陰離子交換層析的填料進行試驗，通過采用相同的純化參數，比較各填料在純化腺病毒過程中的回收率以及最終腺病毒樣品的純度。結果發(fā)現，純度結果最好的是SOURCE 30 Q，達

10、到了85％；回收率最好的也是SOURCE 30 Q，達到了80％，因此使用SOURCE 30 Q作為進一步研究的介質。 本文應用SOURCE 30Q對腺病毒進行純化，建立了以下純化參數： (1).填料體積為300ml； (2).平衡液為20mMTris、150mMNaCl、2mM MgCl2、PH7.5，洗脫液為20mM Tris、1M NaCl、2mM MgCl2、PH7.5； (3).平衡和上樣、洗脫

11、流速均為10ml/min(4)洗脫程序為10個柱體積線性梯度洗脫。按照上述參數純化經超濾濃縮和純化的腺病毒樣品，能夠很好的分離腺病毒、蛋白雜質和核酸雜質，收集到的腺病毒峰中雜質含量極微，經HPLC分析腺病毒純度可以達到99.7％，回收率也達到80％以上。 同時，通過對反應器擴增的病毒上清的純化過程，發(fā)現在300ml體積填料的情況下，其腺病毒載量可以達到2×10<'14>vp，這樣的載量已經基本能滿足大規(guī)模制備腺病毒的需要。此外，

12、腺病毒保存溶液的研究也是一個重要課題。病毒顆粒必須保持它們的結構完整性以保持它們的感染性和生物活性，病毒載體的結構完整性經常在制劑的過程中損壞，這妨礙了它作為基因治療載體的用途。本文制訂了三種腺病毒保存液配方，通過穩(wěn)定性試驗考察腺病毒在這些保存液中的穩(wěn)定性。結果發(fā)現，腺病毒在4℃條件下也能較長期地保存，在配方A和配方C中腺病毒可以在6個月以內一直保持其數量和活性。 總的來說，應用超濾的方法可以將病毒原液中的較小的蛋白分子和雜質初