JAK2特異性抑制劑AG490對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型的Th17-Treg細(xì)胞平衡的影響.pdf

1、目的:探討JAK2抑制劑對(duì)Th17/Treg平衡的影響和對(duì)MS的治療效果。
　　方法:
　　將60只體重在18-22g之間的6-8周齡C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分組為:EAE模型組、AG490干預(yù)組和空白對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)采用以200μl磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解300μg人工合成MOG35-55多肽，再與等量含有4 mg/ml卡介苗的完全福氏佐劑(CFA)充分混合成為油包水乳劑，制備完全抗原將完全抗原皮下注射于雙側(cè)側(cè)腹壁4點(diǎn)位

2、置。EAE模型組和AG490干預(yù)組均于免疫后第0h和48 h于腹腔內(nèi)注射百日咳毒素500 ng，免疫C57BL/6小鼠制備EAE模型。直接將200μl PBS與等量CFA乳化免疫空白對(duì)照組動(dòng)物。于免疫后第3、5、7、9、11、13、15、17、19天給予AG4901mg皮下注射AG490干預(yù)組小鼠至處死，每天給予生理鹽水0.1ml/d空白對(duì)照組和EAE模型組小鼠皮下注射。觀(guān)察藥物對(duì)動(dòng)物臨床表現(xiàn)的影響，免疫后第13天每組隨機(jī)處死小鼠并取材

3、，標(biāo)記為發(fā)病前組，并在約為免疫后第20天記為高峰組每組隨機(jī)處死小鼠并取材。將各實(shí)驗(yàn)組小鼠按不同時(shí)期處死后取脊髓組織進(jìn)行HE染色觀(guān)察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀(guān)察IL-17、Foxp3+、p-STAT5陽(yáng)性細(xì)胞的分布并計(jì)數(shù)，進(jìn)行比較。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，若數(shù)據(jù)不滿(mǎn)足正態(tài)性(P＜0.05)則進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換，多組計(jì)量資料均數(shù)的比較應(yīng)用ANOVA方差分析，組間兩兩比較采

4、用SNK法，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、組織病理學(xué)觀(guān)察
　　(1)空白對(duì)照組脊髓組織免疫后13天及免疫后20天均未觀(guān)察到“血管袖套”現(xiàn)象，且淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)稀疏。
　　(2)免疫后13天AG490干預(yù)組脊髓組織內(nèi)淋巴細(xì)胞多于空白對(duì)照組，“血管袖套”不明顯，但EAE組脊髓組織內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量較AG490干預(yù)組數(shù)量多，且“血管袖套”更明顯。
　　(3)免疫后20天時(shí)EAE組及AG490干預(yù)組較

5、免疫13天時(shí)EAE組及AG490干預(yù)組淋巴細(xì)胞較多，且EAE組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較AG490干預(yù)組更為明顯。
　　2、免疫組化染色結(jié)果觀(guān)察
　　2.1
　　(1) IL-17是由CD4+Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，與MS的發(fā)生密切相關(guān)。主要見(jiàn)于胞漿表達(dá)。
　　(2) Foxp3是維持CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)錄因子，且對(duì)于Treg細(xì)胞來(lái)說(shuō)具有特異性，CD4+CD25+Treg細(xì)胞具有維持免疫平衡的作用，可一

6、定程度上緩解MS的發(fā)展。主要見(jiàn)于胞漿表達(dá)。
　　(3) STAT5為STATs家族蛋白一員，JAK2-STAT5通路參與CD4+CD25+Treg細(xì)胞的活化，p-STAT5為磷酸化后的STAT5。在胞漿和胞核中都可以觀(guān)察到p-STAT5的陽(yáng)性細(xì)胞。
　　2.2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)觀(guān)察
　　2.2.1免疫后13天
　　(1) IL-17 EAE組IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（44.89±10.43）多于A(yíng)G490干預(yù)組（16.00±

7、6.80）且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)兩組IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于空白對(duì)照組（8.22±3.00）且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2) Foxp3 EAE組Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（32.67±11.12）少于A(yíng)G490干預(yù)組（61.00±11.54）且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)兩組Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于空白對(duì)照組（7.56±3.68）且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3) p-S

8、TAT5 EAE組p-STAT5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（28.56±12.80）少于A(yíng)G490干預(yù)組（64.89±23.28）且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)兩組p-STAT5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于空白對(duì)照組（11.22±6.10）且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.2.2免疫后20天
　　(1) IL-17 EAE組IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(57.33±13.36)多于A(yíng)G490干預(yù)組（20.56±5.45）且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

9、＜0.05)，同時(shí)兩組IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于空白對(duì)照組（6.3±3.67）且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　(2) Foxp3 EAE組Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（22.67±6.89）少于A(yíng)G490干預(yù)組（50.11±9.70）且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)兩組Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于空白對(duì)照組（6.33±3.24）且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)p-STAT5 EAE組p-STAT5陽(yáng)性細(xì)

10、胞數(shù)（17.56±7.84）少于A(yíng)G490干預(yù)組（43.44±8.14）且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)兩組p-STAT5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于空白對(duì)照組（8.78±2.11）且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.2.3免疫后13天與免疫后20天對(duì)比
　　(1) IL-17免疫13天時(shí)EAE組IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(44.89±10.43)少于免疫后20天EAE組IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（57.33±13.36）且差別具有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫13天時(shí)AG490干預(yù)組(16.00±6.80)與免疫后20天AG490干預(yù)組（20.56±5.45）IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相比差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩時(shí)期空白對(duì)照組IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(2) Foxp3免疫13天時(shí)EAE組Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（32.67±11.12）多于免疫后20天EAE組Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（22.67±6.89）且差別

12、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫13天時(shí)AG490干預(yù)組Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（61.00±11.54）多于免疫后20天AG490干預(yù)組（50.11±9.70）。兩時(shí)期空白對(duì)照組Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(3)p-STAT5免疫13天時(shí)EAE組p-STAT5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（28.56±12.80）多于免疫后20天EAE組p-STAT5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(17.56±7.84)且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0