PIM1激酶線性泛素化修飾及其功能研究.pdf

1、蛋白激酶PIM是絲/蘇氨酸激酶家族的重要組成部分，包括PIM1、PIM2、PIM3三個(gè)成員，該家族蛋白氨基酸序列同源性很高，功能相近，但其分布具有組織特異性。PIM基因發(fā)揮多方面的生物學(xué)功能，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝、細(xì)胞自噬、胚胎干細(xì)胞干性維持等多個(gè)方面。目前發(fā)現(xiàn)PIM家族在多種惡性腫瘤中高表達(dá)并在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要功能，已成為抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)。在PIM蛋白家族的三個(gè)成員中，尤以PIM1的功能研究最為廣

2、泛，該分子首次被發(fā)現(xiàn)時(shí)定義為鼠的白血病前病毒插入位點(diǎn)，它編碼34KD和44KD兩個(gè)亞型的蛋白。PIM1蛋白是一個(gè)刺激反應(yīng)性蛋白，其表達(dá)水平受多種因素誘導(dǎo)，例如:GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-5、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、EPO、PMA、干擾素γ等均可誘導(dǎo)其高表達(dá)。PIM1蛋白通過磷酸化不同的底物蛋白從而參與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等多方面功能。在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面，重要的信號(hào)通路Jak-STAT和NF-κB

3、通過促進(jìn)PIM1基因轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)PIM1的表達(dá)水平，另一方面，高表達(dá)的PIM1蛋白又能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)這兩條信號(hào)通路抑制其持續(xù)激活。細(xì)胞周期方面，PIM1可在不同時(shí)期通過磷酸化檢查點(diǎn)蛋白Cdc25A或者Cdc25C影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S或G2/M檢查點(diǎn)的轉(zhuǎn)換;另外PIM1還可通過磷酸化激酶CDK的抑制分子p27Kip1，促進(jìn)p27降解，進(jìn)而加速細(xì)胞周期進(jìn)程。細(xì)胞凋亡方面，PIM1通過磷酸化促凋亡蛋白BAD引發(fā)BAD蛋白的

4、降解，從而抑制細(xì)胞凋亡并提高細(xì)胞存活能力。美國圣地亞哥大學(xué)Mark Sussman等研究證明，PIM1可以通過磷酸化線粒體膜蛋白Drp1從而抑制其線粒體轉(zhuǎn)位，保護(hù)心肌細(xì)胞免受死亡，PIM1已成為缺血性心肌損傷治療的新靶點(diǎn)。
　　泛素化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，它參與調(diào)控細(xì)胞的周期進(jìn)程、基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)方面。已知的泛素化修飾包括單泛素化和多泛素化兩種類型，關(guān)于它們的生物學(xué)功能目前已被廣泛研究。近年來國

5、際上報(bào)導(dǎo)了一種全新的泛素化修飾形式—線性泛素化，它是將泛素以首尾相連的方式共價(jià)結(jié)合到底物蛋白分子的賴氨酸殘基上，完成對(duì)底物蛋白的修飾。2009年日本科學(xué)家Kazuhiro Iwai首次報(bào)道NF-κB信號(hào)通路中IKK復(fù)合物的成員NEMO能夠發(fā)生線性泛素化修飾，這種修飾會(huì)改變NEMO自身構(gòu)象，增強(qiáng)IKK復(fù)合體的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的激活。NEMO是已知能夠發(fā)生線性泛素化修飾的蛋白分子，其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含有一個(gè)親和線性泛素化鏈的

6、UBAN結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠招募線性泛素化鏈，從而使NEMO分子發(fā)生聚合。本項(xiàng)研究以線性泛素化修飾作為切入點(diǎn)，希望發(fā)現(xiàn)新的線性泛素化底物分子，并研究其生物學(xué)功能。
　　我們利用UBAN結(jié)構(gòu)域的特殊氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選到若干潛在的能夠發(fā)生線性泛素化修飾的蛋白分子，其中PIM1蛋白是底物候選分子之一。近年來關(guān)于PIM1功能研究的報(bào)道很多，其發(fā)揮生物學(xué)作用依賴于絲/蘇氨酸激酶活性，科學(xué)家們一直致力于研究激酶PIM1的小分子

7、抑制劑作為抗腫瘤藥物，因此PIM1激酶活性的調(diào)控成為研究重點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道PIM1激酶活性主要受其表達(dá)水平和穩(wěn)定性的調(diào)控，它通常是以泛素—蛋白酶體途徑降解從而影響穩(wěn)定性，那么PIM1蛋白能否通過線性泛素化修飾機(jī)制調(diào)控其激酶活性有待于深入研究。本項(xiàng)研究我們通過泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PIM1蛋白分子能夠發(fā)生線性泛素化修飾，并進(jìn)一步探討了這種特殊翻譯后修飾的生物學(xué)功能。
　　首先我們通過PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得PIM1基因片段，經(jīng)過HindⅢ和Ec

8、oRⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶酶切得到具有相同酶切位點(diǎn)的PIM1基因片段和pcDNA3.0載體片段，利用T4 DNA連接酶將PIM1基因片段插入載體中，構(gòu)建表達(dá)良好的Flag-PIM1質(zhì)粒，為后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)奠定良好基礎(chǔ)。在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)線性泛素化E3酶HOIP、HOIL-1L、SHARPIN及Flag-PIM1質(zhì)粒，通過免疫沉淀（IP）方法富集PIM1蛋白，利用線性泛素化抗體免疫印跡發(fā)現(xiàn)過表達(dá)E3酶后，PIM1發(fā)生明顯的線性泛素化

9、修飾現(xiàn)象，而陰性對(duì)照組不能觀察到該現(xiàn)象，說明PIM1蛋白在過表達(dá)體系下能夠發(fā)生線性泛素化修飾。為了進(jìn)一步確認(rèn)這一現(xiàn)象并鑒定線性泛素化修飾的賴氨酸殘基位點(diǎn)，我們?cè)贖EK293T細(xì)胞中過表達(dá)PIM1及線性泛素化E3酶和泛素Ubiquitin，通過IP手段富集線性泛素化修飾的PIM1蛋白分子，經(jīng)過蛋白洗脫，超濾等過程，制備PIM1蛋白樣品并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示PIM1蛋白酶解的肽段中含有氨基酸序列為GGMQIF（G-甘氨酸，M-甲硫

10、氨酸，Q-谷氨酰胺，I-異亮氨酸，F(xiàn)-苯丙氨酸）的多肽片段，此序列為線性泛素化鏈的特征序列，證明了PIM1線性泛素化修飾的存在。此外，質(zhì)譜分析結(jié)果提示K67和K169賴氨酸位點(diǎn)可能作為線性泛素化修飾的位點(diǎn)，因此進(jìn)一步研究擬構(gòu)建這兩個(gè)位點(diǎn)的突變體，通過泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它們是否為線性泛素化修飾位點(diǎn)。
　　PIM1蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的重要生物學(xué)功能依賴于其對(duì)眾多底物蛋白的磷酸化修飾，因此我們利用體外激酶實(shí)驗(yàn)研究PIM1線性泛素化修飾是否影響

11、了它的激酶活性。在激酶反應(yīng)體系中，加入純化的組蛋白H3作為PIM1激酶底物、能量ATP、激酶PIM1，以激酶Aurora磷酸化組蛋白H3作為實(shí)驗(yàn)體系的陽性對(duì)照。體外激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未修飾PIM1對(duì)照組相比，線性泛素化修飾PIM1導(dǎo)致的組蛋白H3磷酸化水平明顯降低，說明PIM1線性泛素化修飾能夠抑制其激酶活性。
　　綜上，我們發(fā)現(xiàn)了PIM1蛋白一種新的翻譯后修飾方式—線性泛素化修飾，并利用質(zhì)譜方法鑒定了潛在的線性泛素化修飾賴氨酸